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luocongqiang鐵蟲 (小有名氣)
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western blot
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| western blot 可以檢測(cè)原核生物蛋白嗎 |
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鐵蟲 (初入文壇)
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2樓2013-05-30 17:56:48
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【答案】應(yīng)助回帖
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做wb你首先要清楚它的作用是什么，最基本的要搞懂在下手做實(shí)驗(yàn)。 以下是wb的詳細(xì)信息供你參考，以后發(fā)帖盡可能發(fā)比較高級(jí)的帖子小蟲子給的金幣也不少哇。免疫印跡技術(shù)又稱蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)是一種借助抗原鑒定特異性抗體的有效方法，該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)可提取性核抗原(ENA)抗體為例。 【實(shí)驗(yàn)原理】 先將ENA混合抗原經(jīng)SDS-PAGE電泳，使各種抗原成分根據(jù)分子量不同區(qū)分開來，再通過電轉(zhuǎn)印將各種抗原成分轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素薄膜上，血清中抗ENA抗體與硝酸纖維素薄膜上的ENA抗原成分結(jié)合，再與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG抗體結(jié)合，形成抗原抗體酶標(biāo)抗體復(fù)合物，洗滌后加入底物顯色，根據(jù)有無顯色帶的出現(xiàn)判斷抗ENA抗體的有無，顯色帶的位置判斷抗ENA抗體的類型。 【主要試劑與器材】 1.ENA多肽抗體譜檢測(cè)試劑盒 包括印有ENA的硝酸纖維素薄膜、堿性磷酸酶記標(biāo)的抗人IgG抗體、顯色液(BCIP/NBT)、濃縮洗滌液和樣品緩沖液、終止液、ENA多肽抗體標(biāo)準(zhǔn)帶圖譜等，有商品供應(yīng)。 2.待檢血清和陽性質(zhì)控血清 3.小型搖床、恒溫箱、反應(yīng)槽、吸管、微量移液器、濾紙等。 【操作方法】 1.將濃縮洗滌液、樣品稀釋液按說明書用蒸餾水進(jìn)行稀釋。 2.抗原條放入反應(yīng)槽中，每個(gè)槽內(nèi)加入樣品稀釋液1.5ml浸泡5min后，棄去槽內(nèi)液體。 3.用樣品稀釋液將血清1∶10稀釋，吸取1.5ml稀釋血清加入槽內(nèi)，置小型搖床上孵育30min。 4.棄去槽內(nèi)液體，每個(gè)槽內(nèi)加入1∶10稀釋的洗滌液 1.5ml浸泡5min后，棄去槽內(nèi)液體，用吸水紙吸干。 5.吸取1.5ml用樣品稀釋液1∶10稀釋AP標(biāo)記的抗人 IgG，加入槽內(nèi)，置小型搖床上孵育30min。 6. 同4洗滌。 7.每個(gè)槽內(nèi)加入底物液1.5ml，置小型搖床上孵育 20min后，棄去槽內(nèi)液體，用自來水洗凈，加入終止液。 8.與標(biāo)準(zhǔn)顯色帶比較，判斷結(jié)果。 【結(jié)果判斷】 將印跡膜上出現(xiàn)的顯色區(qū)帶與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較，可判斷哪種ENA抗體陽性。 【注意事項(xiàng)】 1.洗滌液需在37℃預(yù)熱，且實(shí)驗(yàn)過程都用預(yù)熱洗滌液。 2.顯色時(shí)，必需使用小型搖床搖動(dòng)反應(yīng)槽，使染色均勻。顯色時(shí)間可根據(jù)質(zhì)控血清顯色清晰為準(zhǔn)。 3.不同批號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)帶圖譜不可混用。 【應(yīng)用與評(píng)價(jià)】 1.免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)具有電泳技術(shù)分辨力強(qiáng)及免疫反應(yīng)特異性強(qiáng)和免疫標(biāo)記技術(shù)靈敏度高的特點(diǎn)，可檢出最小蛋白量達(dá)1pg；不需要純化抗原，可在同一印跡條上作多種抗體檢測(cè)；用酶標(biāo)抗體法進(jìn)行顯色，結(jié)果比較清晰，便于觀察；結(jié)果便于保存，印跡膜可存放6～12月；由于SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)移步驟復(fù)雜、技術(shù)性強(qiáng)、影響因素多、不容易掌握，不太適合臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展，但是使用商品化的印跡膜使檢測(cè)方法變得非常簡(jiǎn)單，一般基層醫(yī)院都能開展。 2.核內(nèi)可提取性抗原ENA是核物質(zhì)中一類蛋白的總稱。因這類核蛋白的共同特點(diǎn)是不含有組蛋白，且均能浴于生理鹽水和磷酸鹽緩沖液，故被稱為核內(nèi)可提取性抗原。其大多數(shù)屬于酸性蛋白，對(duì)RNA酶敏感，56℃10min即可使其滅活。針對(duì)這些抗原產(chǎn)生的抗體，被稱為抗ENA抗體。其各自的臨床意義有所不同，以下列舉常見的幾種： 抗Sm：SLE的標(biāo)記性抗體 抗U1RNP：混合性結(jié)締組織病(MCTD)中陽性率極高，達(dá) 95%以上。 抗SSA：在SLE等風(fēng)濕病中均可出現(xiàn)，常與抗SSB同時(shí)出現(xiàn)，提示干燥綜合癥的可能。 抗SSB：常與抗SSA同時(shí)出現(xiàn)，提示干燥綜合癥的可能。 抗Scl-70：陽性提示多發(fā)性硬化癥的可能。 抗Jo-1：陽性提示多發(fā)性肌炎、皮肌炎的可能。 抗rRNP：SLE患者神經(jīng)受累的標(biāo)記性抗體 |
3樓2013-05-30 18:49:16
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