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119904386鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
16s引物擴增大腸桿菌，產(chǎn)物不是1500，而是在700上下各有一條帶
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用的是這對引物： 16s-F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 16s-R：5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 開始是因為拿這對引物擴增芽孢桿菌得不到目的條帶，直接做的菌液PCR，未煮沸也沒提取DNA。于是就懷疑芽孢菌是不是形成芽孢后95度預(yù)變性破壞不了菌體（預(yù)變性10min還是不行），無法釋放出DNA模板。所以，想拿G-菌（大腸桿菌）做個對照。奇怪的是，大腸桿菌的擴增產(chǎn)物并不是1.5kb，而是在marker 700bp上下各有一條帶（也許加起來1.5kb），同時芽孢菌還是沒有帶 求解 |
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志子
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
laozuzunzhe: 金幣+4, good！ 2013-06-11 12:43:28
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預(yù)變性時間、退火溫度、引物用量是主要影響因素，可從這幾方面去做正交試驗探索。 菌沒有完全裂解，則試沸水浴或延長預(yù)變性時間。 引物如果反復(fù)凍融的話有可能會裂解斷裂。 菌株的遺傳性狀不穩(wěn)定，或許在傳代的過程中產(chǎn)生了突變；菌株不純，體系中出現(xiàn)了污染也有可能的。導(dǎo)致模板不純。 菌株正常，會不會是引物濃度太高，如果引物的濃度很高產(chǎn)生引物二聚體的概率就比較高。 |
2樓2013-06-10 22:52:43
肥貓p
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3樓2013-06-12 10:33:49
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