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小科研女dow木蟲(chóng) (小有名氣)
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蛋白表達(dá)不出來(lái)，是什么原因造成的 已有1人參與
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各位蟲(chóng)友，我之前一直在做基因文庫(kù)，好不容易從文庫(kù)中篩到了具有我要的酶活性的克隆子。但是通過(guò)測(cè)序，是一條具有好幾個(gè)閱讀框的基因片段，但是發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有相似甚至相關(guān)的酶的基因，都是一些膜蛋白組件，還有幾個(gè)是沒(méi)有報(bào)道的未知蛋白，可是通過(guò)活性檢測(cè)，明明是有活性的。 我的做法就是，將測(cè)序結(jié)果分析閱讀框，挑了幾個(gè)較大的閱讀框（2000bp-500bp）都分別設(shè)計(jì)引物克隆表達(dá)，但是都做了4個(gè)了，都沒(méi)有表達(dá)出蛋白，是一點(diǎn)都沒(méi)有啊。 請(qǐng)問(wèn)這是怎么回事？是不是不是所有的完整閱讀框都能表達(dá)蛋白，只是有功能性的蛋白可以表達(dá)？ |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 實(shí)驗(yàn)技術(shù)、方法交流 |
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凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2013-06-22 18:49:41
kx444555: 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2013-06-22 18:49:41
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高效質(zhì)粒載體表達(dá)外源基因的一般方法（原核表達(dá)系統(tǒng)）: （1）表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì)：構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)首先要考慮使目標(biāo)基因的翻譯起始密碼ATG 與 SD 序列之間的距離和堿基組成處于一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的變化對(duì) mRNA 的翻譯效率有顯著影響，具體表現(xiàn)為：SD序列 UAAGGAGG的翻譯效率要比 AAGGA 高3-6倍；翻譯起始密碼 ATG 與 UAAGGAGG的最適距離是6-8個(gè)堿基長(zhǎng)度，與 AAGAA 的最適距離是5-7個(gè)堿基長(zhǎng)度；ATG 與 UAAGGAGG 至少相隔 3-4個(gè)堿基，與 AAGAA 至少相隔5 個(gè)堿基mRNA 的翻譯才能進(jìn)行；ATG與SD序列之間的堿基組成為A，T 堿基豐富時(shí)，mRNA 翻譯效率較高。其次，盡量提高核糖體結(jié)合位點(diǎn)本身和附近的序列中 A/T 堿基的含量，降低mRNA 5’ 端形成的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)的可能性，也是構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)需要注意的事項(xiàng)。在必要的情況下，還可通過(guò)定點(diǎn)突變，PCR 等技術(shù)改變個(gè)別關(guān)鍵的堿基來(lái)破壞mRNA 5’端的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)。把目標(biāo)基因設(shè)計(jì)成多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)，在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個(gè)SD序列和目標(biāo)基因，一起插入表達(dá)載體。這一方法通常適用于目標(biāo)基因 5’端序列容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，而又不宜改變其序列的情形下。再者，在構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，充分利用各個(gè)基因的結(jié)構(gòu)特征和特點(diǎn)，注意引入翻譯增強(qiáng)子序列。（2）共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因：由于同義密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)對(duì)應(yīng)的tRNA的豐度有正比關(guān)系稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA的豐度很低，有可能在翻譯過(guò)程中發(fā)生中止和移碼突變�？刹捎�1.通過(guò)基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率高的同義密碼子；2.在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)稀有密碼子tRNA 基因，以提高大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)稀有密碼子 tRNA 的豐度。（3）提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性：利用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把目標(biāo)蛋白最終累積在周質(zhì)空間，或分泌到培養(yǎng)基中；采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌；對(duì)分子量較小的目標(biāo)基因進(jìn)行融合表達(dá)或串聯(lián)聚合表達(dá)；共表達(dá)能提高特定目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因；對(duì)蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行改造；在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。（4）高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞：：大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)過(guò)程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個(gè)菌體對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)水平基本不變的前提下，通過(guò)單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來(lái)實(shí)現(xiàn)總表達(dá)量的提高。目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補(bǔ)料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種。工程化宿主細(xì)胞：1.構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌是解決高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長(zhǎng)密度較高，培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低，氧氣的不足導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)速率降低和乙酸的累積，乙酸的存在對(duì)目標(biāo)基因的高效表達(dá)有明顯的阻抑作用的根本途徑。利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對(duì)氧的利用率的生物學(xué)性質(zhì)，把透明顫菌血紅蛋白基因vgb 導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)以增加其對(duì)溶氧的寬容度。從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值；用基因敲除技術(shù)缺失大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因ackA，使從丙酮酸到乙酸的合成途徑被阻斷；改變代謝流的方向，通過(guò)共轉(zhuǎn)化把枯草桿菌、釀酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS，單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因 pdc1 和乙醇脫氫酶基因 adh2 導(dǎo)入大腸桿菌，使丙酮酸的代謝有選擇地向生成3-羥基丁酮或乙醇的方向進(jìn)行。2.構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌：rpoH基因編碼大腸桿RNA聚合酶的r32亞基，r32 亞基對(duì)大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調(diào)控作用。rpoH 基因缺陷的突變株己經(jīng)被構(gòu)建，研究結(jié)果表明它能明顯提高目標(biāo)基因的表達(dá)水平。 |
4樓2013-06-20 22:01:05
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kx444555: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2013-06-22 18:47:33
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你是在原核細(xì)胞中表達(dá)？我先按照這個(gè)說(shuō)，若不是你說(shuō)出來(lái)，我在按照真核表達(dá)系統(tǒng)說(shuō)。 克隆金銀的表達(dá)，除了需要啟動(dòng)子外，還要Shine-Dalgarno Sequence (SD序列）。Shine-Dalgarno Sequence一般位于-10及翻譯起始密碼子ATG之間，是mRNA與16SrRNA結(jié)合時(shí)所必須。Shine-Dalgarno Sequence與翻譯起始密碼子ATG之間的距離會(huì)影響基因的表達(dá)。此距離的大小與不同的啟動(dòng)子有關(guān)，一般7-9個(gè)堿基。 |
2樓2013-06-20 21:53:35
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kx444555: 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2013-06-22 18:49:48
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克隆基因與表達(dá)基因時(shí)也要對(duì)coding sequence和coding region加以注意。 因?yàn)檎婧思?xì)胞中的翻譯后加工過(guò)程肯定比原核生物要復(fù)雜很多，所以有些的出現(xiàn)在編碼區(qū)的終止密碼子在真核細(xì)胞中會(huì)得到糾正，但是在原核細(xì)胞中可能無(wú)法糾正，導(dǎo)致表達(dá)失敗。所以在構(gòu)建載體時(shí)應(yīng)該盡量不要讓真核基因的編碼區(qū)的終止密碼子存在，構(gòu)架基因時(shí)就應(yīng)該加以修訂，改變非終止�？梢杂密浖笾履M一下要表達(dá)的蛋白質(zhì)（如果已有天然構(gòu)象就不用做了），大致知道編碼區(qū)的終止密碼子存在與蛋白質(zhì)什么位置，如果知道天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列就直接改成成熟的蛋白質(zhì)的此位點(diǎn)的氨基酸的密碼子，如果不知道知道天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列就直接改成成熟的蛋白質(zhì)的此位點(diǎn)的氨基酸那么就改為其同一條肽鏈的同種構(gòu)象部分的相鄰氨基酸殘基的同屬性的氨基酸的密碼子。 另外，有時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)給出的編碼區(qū)，未必就是真的編碼區(qū)，可能就是全基因序列，包括5’-UTR,3’-UTR,intron和exon。你適當(dāng)?shù)亩嗖钜恍⿺?shù)據(jù)庫(kù)和原始論文。因?yàn)椴簧偃藢?duì)coding sequence和coding region不同的理解。 關(guān)于編碼區(qū)（cds）說(shuō)明幾點(diǎn)（給出具體文獻(xiàn)�。�----我早些時(shí)間回答的帖子（把內(nèi)容合并到一起）： http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6010888 1.編碼區(qū)（cds）就是指成熟mRNA的外顯子（exon）區(qū)域，有些mRNA的前體切割下的內(nèi)含子(intron)區(qū)域也可以編碼，比如snoRNA就是用一些mRNA的內(nèi)含子(intron)編碼的，那種情況相對(duì)而言比較少見(jiàn)。 cds定義： http://www.answers.com/topic/coding-region “Oxford Dictionary of Biochemistry: coding region or coding sequence or coding sequence 1.(of a DNA molecule) an alternative name for exon. 2.(of a messenger RNA molecule) the portion of its complete nucleotide sequence that is translatable into polypeptide. It starts with the initiation codon AUG and ends with one of the termination codons UAA, UAG, or UGA.” Read more: http://www.answers.com/topic/coding-region#ixzz2WMqFAxT2 另見(jiàn)：B.Lewin,Genes IX,JONES AND BARTLETT PUBLISHERS,2008,P848: "A coding region is a part of the gene that represents a protein sequence." 2.不同的基因可能編碼區(qū)域會(huì)有所重疊（即讀碼框不同），比如抗體的可變區(qū)的編碼區(qū)。 3編碼區(qū)（cds）內(nèi)有時(shí)的確會(huì)有終止密碼子存在，我就是說(shuō)外顯子序列，這時(shí)細(xì)胞（原核細(xì)胞、真核細(xì)胞都包括，還包括病毒侵入原核細(xì)胞、真核細(xì)胞后的病毒基因的翻譯情況）的轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯可能會(huì)采取三種措施來(lái)消除終止密碼子的翻譯終止的作用：（1）RNA modification（原位改變堿基或者糖環(huán)）。（2）RNA editing（既有原位改變堿基又有插入或刪除剪輯）。RNA modification與RNA editing的除改變位點(diǎn)外的其他區(qū)別在：RNA modification的種類(lèi)比RNA editing要多很多；RNA editing可以插入和刪除RNA的堿基----及改變RNA的堿基數(shù)量，RNA修飾不會(huì)；RNA editing的后果很多與翻譯直接相關(guān)，RNA modification不強(qiáng)調(diào)這點(diǎn)。（3）Translational Hopping.翻譯跳讀，核糖體在翻譯時(shí)有一段編碼區(qū)不翻譯直接跳過(guò)，并且可能造成以后的ORF的改變，比如T4噬菌體。（4）Recoding。比如特殊位置的UGA可以編碼硒代半胱氨酸，Selenocysteine，這是改變密碼子的原始含義；但是還有另外的情況：核糖體在翻譯時(shí)發(fā)生編碼框的移動(dòng)，經(jīng)常是以一個(gè)堿基的位置，并且可能造成以后的ORF的改變；最后核糖體翻譯一個(gè)氨基酸而直接占用四個(gè)堿基并且造成以后的ORF的改變。 2與3參考文獻(xiàn)： (1)B.Lewin,Genes IX,JONES AND BARTLETT PUBLISHERS,2008,P37-54; (2)M.B.Mathews,N.Sonenberg,J.W.B.Hershey edit,Translational Control in Biology and Medicine,Cold Spring Habor Laboratory Press,2007,,P625-654. 基因是包括內(nèi)含子的！ 基因的定義： "A segment of a DNA molecule that contains the information required for the synthesis of a functional biological product,whether protein and RNA ,is referred to as gene." ------From David L.Nelson,Michael M.Cox,Lehinger Pricinples of Biochemistry, W.H.Freeman and Company, 2008,5th edition,P271. 數(shù)據(jù)庫(kù)給出的完整的基因的堿基序列包括外顯子、內(nèi)含子、5’-UTR和3'UTR，如此完整的基因的堿基序列里含有多個(gè)終止子密碼這不奇怪的；何況還沒(méi)有考慮外顯子在翻譯水平和轉(zhuǎn)錄后水平的加工修飾去除掉外顯子中的多余的終止密碼子。 因?yàn)樾∧鞠x(chóng)的帖子流動(dòng)性非常大，所以我回答問(wèn)題還是盡量完整，有些重復(fù)性?xún)?nèi)容有時(shí)候不可避免！  |
5樓2013-06-20 22:36:16
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[考研] 080500求調(diào)劑 +3 | zzzzfan 2026-03-24 | 3/150 |
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