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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 微生物 » 實驗/技術 » 載體酶切位點與目的片段重復
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[求助]
載體酶切位點與目的片段重復
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| 第一次做分子實驗，選擇了PMD-19T載體，連接目的片段后，再亞克隆到PET-28a上，現(xiàn)在遇到了個問題，就是當時在設計引物加酶切位點時，只考慮到了PET-28a和目的片段，設計出的酶切位點在PMD-19T上都有，怎么吧啊，可以用嗎，加的位點是HindⅢ和EcoRⅠ。。。。大家?guī)蛶兔Π�。�！? |
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3樓2013-06-25 12:36:06
【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
zhangxingc: 金幣+3, 鼓勵新蟲應助，歡迎常到微生物版 2013-06-25 11:41:38
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zhangxingc: 金幣+3, 鼓勵新蟲應助，歡迎常到微生物版 2013-06-25 11:41:38
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和我用的酶切位點是一樣的，我用了pEt28a+ PMD-19T載體應該只是一個保留這個目的片段的把？用PCR擴增，設計引物，這時候引物就該注意點了，引物就包括ECORI 和HindIII酶切位點最好再弄點你們的目標基因的片段，要不然估計會把PMD-19T的基因給擴增出來，這樣子就只擴增含有酶切位點的目標基因了，然后瓊脂糖電泳一下看看有沒有擴增出來目標基因。 隨后目標基因和pEt28a+同時進行雙酶切，DNA連接酶16℃連接過夜，然后再做一個瓊脂糖電泳，一個是連接之后的，還有一個是沒有連接的目標基因和pet28a都進行酶切之后的混合液，跑完電泳看看有沒有順利連接就好了。 |
2樓2013-06-25 11:34:00
kehuang611
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- 專業(yè): 微生物生態(tài)學
4樓2013-06-25 12:56:09
kehuang611
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zhangxingc: 金幣+3, 鼓勵新蟲積極應助 2013-06-25 13:29:04
zhangxingc: 金幣+3, 鼓勵新蟲積極應助 2013-06-25 13:29:04
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在目的片段與PMD-19T連接后，實驗預計是用上面兩個酶將目的片段切下來，然后電泳，切膠回收目的片段，然后連接PET-28a，但是比如載體ECORI到目的片段ECORI距離是A，目的片段長是B，目的片段hindIII到載體hindIII的距離是C，雙酶切后得到的片段長度可能是A+B,A+B+C,B+C,A,B,C。這可怎么辦，需要重新設計一條只在pet-28a上有的酶切位點的引物嗎？ 還有這種說法就有問題，樓主應該明白酶切的話只要在酶量做夠時，只要有酶切位點就會切開，所以酶切后剩下的只會是帶兩段酶切末端的你的片段。 |
5樓2013-06-25 12:59:20
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