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MOQIA1989新蟲 (初入文壇)
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[求助]
載體酶切位點(diǎn)與目的片段重復(fù)
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| 第一次做分子實(shí)驗(yàn)，選擇了PMD-19T載體，連接目的片段后，再亞克隆到PET-28a上，現(xiàn)在遇到了個(gè)問(wèn)題，就是當(dāng)時(shí)在設(shè)計(jì)引物加酶切位點(diǎn)時(shí)，只考慮到了PET-28a和目的片段，設(shè)計(jì)出的酶切位點(diǎn)在PMD-19T上都有，怎么吧啊，可以用嗎，加的位點(diǎn)是HindⅢ和EcoRⅠ。。。。大家?guī)蛶兔Π�。�！? |
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kehuang611
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4樓2013-06-25 12:56:09
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhangxingc: 金幣+3, 鼓勵(lì)新蟲應(yīng)助，歡迎常到微生物版 2013-06-25 11:41:38
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhangxingc: 金幣+3, 鼓勵(lì)新蟲應(yīng)助，歡迎常到微生物版 2013-06-25 11:41:38
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和我用的酶切位點(diǎn)是一樣的，我用了pEt28a+ PMD-19T載體應(yīng)該只是一個(gè)保留這個(gè)目的片段的把？用PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)引物，這時(shí)候引物就該注意點(diǎn)了，引物就包括ECORI 和HindIII酶切位點(diǎn)最好再弄點(diǎn)你們的目標(biāo)基因的片段，要不然估計(jì)會(huì)把PMD-19T的基因給擴(kuò)增出來(lái)，這樣子就只擴(kuò)增含有酶切位點(diǎn)的目標(biāo)基因了，然后瓊脂糖電泳一下看看有沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)目標(biāo)基因。 隨后目標(biāo)基因和pEt28a+同時(shí)進(jìn)行雙酶切，DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，然后再做一個(gè)瓊脂糖電泳，一個(gè)是連接之后的，還有一個(gè)是沒(méi)有連接的目標(biāo)基因和pet28a都進(jìn)行酶切之后的混合液，跑完電泳看看有沒(méi)有順利連接就好了。 |
2樓2013-06-25 11:34:00
MOQIA1989
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3樓2013-06-25 12:36:06
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zhangxingc: 金幣+3, 鼓勵(lì)新蟲積極應(yīng)助 2013-06-25 13:29:04
zhangxingc: 金幣+3, 鼓勵(lì)新蟲積極應(yīng)助 2013-06-25 13:29:04
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在目的片段與PMD-19T連接后，實(shí)驗(yàn)預(yù)計(jì)是用上面兩個(gè)酶將目的片段切下來(lái)，然后電泳，切膠回收目的片段，然后連接PET-28a，但是比如載體ECORI到目的片段ECORI距離是A，目的片段長(zhǎng)是B，目的片段hindIII到載體hindIII的距離是C，雙酶切后得到的片段長(zhǎng)度可能是A+B,A+B+C,B+C,A,B,C。這可怎么辦，需要重新設(shè)計(jì)一條只在pet-28a上有的酶切位點(diǎn)的引物嗎？ 還有這種說(shuō)法就有問(wèn)題，樓主應(yīng)該明白酶切的話只要在酶量做夠時(shí)，只要有酶切位點(diǎn)就會(huì)切開，所以酶切后剩下的只會(huì)是帶兩段酶切末端的你的片段。 |
5樓2013-06-25 12:59:20
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