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urbest金蟲 (正式寫手)
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[求助]
求助——質(zhì)粒構(gòu)建問題
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事情是這樣的，我最近在構(gòu)建一個質(zhì)粒，將一個DNA片段使用引物擴(kuò)增后，DNA和質(zhì)粒均做雙酶切，T4連接，轉(zhuǎn)化、圖板、挑克隆、搖菌、抽質(zhì)粒。 我將質(zhì)粒作為模板，使用引物擴(kuò)增，某些質(zhì)粒可以擴(kuò)出目的條帶，將PCR產(chǎn)物測序，得到正確的序列。 然后我吸取5ul陽性質(zhì)粒的菌液，放入5ml LB培養(yǎng)基+氨芐，重新?lián)u菌抽質(zhì)粒，這次直接拿質(zhì)粒測序，結(jié)果測序結(jié)果雜亂無比，全是雜峰。 然后我就用上次抽出來的測序正確的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化、圖板、挑克隆、搖菌，抽質(zhì)粒，得到的質(zhì)粒再次進(jìn)行PCR，多次均未得到目的條帶，只有幾千bp那里有條帶。應(yīng)該不是PCR技術(shù)的問題，因為我拿第一次的質(zhì)粒做了陽性對照，可以P出來。 難道拿正確的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化，再挑克隆出來的質(zhì)粒，跟老質(zhì)粒會不一樣嗎？或者干脆就是雜菌？我加了氨芐了啊。 我現(xiàn)在應(yīng)該怎么辦？拿第一次的菌板出來重新挑克隆，還是從頭開始重新構(gòu)建質(zhì)粒，或者有什么別的辦法？ 這到底是怎么回事，真心求指導(dǎo)。 [ Last edited by 1949stone on 2013-6-25 at 12:25 ] |
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首先一點就是，你擴(kuò)增出目的條帶后，送測序的不應(yīng)該是PCR產(chǎn)物。 我建議的步驟是： 1，將DNA片段使用引物擴(kuò)增后，DNA和質(zhì)粒均做雙酶切，T4連接，轉(zhuǎn)化、涂板。 2，做菌落PCR，跑膠后，眺取有目的條帶的菌落放入5ml LB培養(yǎng)基+氨芐，提質(zhì)粒。（如果菌落太小，可以直接多挑一些單菌落，直接搖5ml LB培養(yǎng)基+氨芐，之后做菌液PCR） 3，如果覺得不放心，可以將提出來的質(zhì)粒作為模板，做質(zhì)粒PCR。 4，送測序。 |
3樓2013-06-25 14:10:35
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建議： 1. PCR 擴(kuò)增目的條帶，連接到T載體上，轉(zhuǎn)化涂板，挑單克隆，PCR檢測有目的條帶的單克隆挑選出來測序。 2. 用測序正確的單克隆，搖菌，提質(zhì)粒 3. 將2中的質(zhì)粒、目的載體分別雙酶切（確保該酶切位點在T載體和目標(biāo)載體中不存在） 4. 電泳回收目的條帶（包括目的產(chǎn)物和載體），進(jìn)行連接 5. 轉(zhuǎn)化、涂板，PCR檢測是否有目的條帶后，送出測序。 按這個程序走，一般都會拿到想要的結(jié)果。 |
5樓2013-07-04 11:26:00
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