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urbest金蟲 (正式寫手)
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[求助]
求助——質(zhì)粒構建問題
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事情是這樣的，我最近在構建一個質(zhì)粒，將一個DNA片段使用引物擴增后，DNA和質(zhì)粒均做雙酶切，T4連接，轉(zhuǎn)化、圖板、挑克隆、搖菌、抽質(zhì)粒。 我將質(zhì)粒作為模板，使用引物擴增，某些質(zhì)�？梢詳U出目的條帶，將PCR產(chǎn)物測序，得到正確的序列。 然后我吸取5ul陽性質(zhì)粒的菌液，放入5ml LB培養(yǎng)基+氨芐，重新?lián)u菌抽質(zhì)粒，這次直接拿質(zhì)粒測序，結(jié)果測序結(jié)果雜亂無比，全是雜峰。 然后我就用上次抽出來的測序正確的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化、圖板、挑克隆、搖菌，抽質(zhì)粒，得到的質(zhì)粒再次進行PCR，多次均未得到目的條帶，只有幾千bp那里有條帶。應該不是PCR技術的問題，因為我拿第一次的質(zhì)粒做了陽性對照，可以P出來。 難道拿正確的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化，再挑克隆出來的質(zhì)粒，跟老質(zhì)粒會不一樣嗎？或者干脆就是雜菌？我加了氨芐了啊。 我現(xiàn)在應該怎么辦？拿第一次的菌板出來重新挑克隆，還是從頭開始重新構建質(zhì)粒，或者有什么別的辦法？ 這到底是怎么回事，真心求指導。 [ Last edited by 1949stone on 2013-6-25 at 12:25 ] |
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首先一點就是，你擴增出目的條帶后，送測序的不應該是PCR產(chǎn)物。 我建議的步驟是： 1，將DNA片段使用引物擴增后，DNA和質(zhì)粒均做雙酶切，T4連接，轉(zhuǎn)化、涂板。 2，做菌落PCR，跑膠后，眺取有目的條帶的菌落放入5ml LB培養(yǎng)基+氨芐，提質(zhì)粒。（如果菌落太小，可以直接多挑一些單菌落，直接搖5ml LB培養(yǎng)基+氨芐，之后做菌液PCR） 3，如果覺得不放心，可以將提出來的質(zhì)粒作為模板，做質(zhì)粒PCR。 4，送測序。 |
3樓2013-06-25 14:10:35
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4樓2013-06-25 21:30:18
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