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殺生丸殿下_q銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
夏天Western Blot 曝光總是白片
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請教各位WB高手 有沒有遇到過夏天（外界氣溫較高）做WB 膠片曝光曝不出來的情況？ 我們實(shí)驗(yàn)室長期都在做WB 在天氣冷的時(shí)候做WB一點(diǎn)問題沒有 可是到了天熱 WB總是大把大把白片情況出現(xiàn) 以下是我們采取的對策 1顯影定影是剛換的 2 一抗為冰箱4度孵育過夜（12h） 3 二抗則是4攝氏度冰箱孵育 （怕牛奶HRP的二抗發(fā)酵壞掉 一般二抗孵育小于8h ） 3曝光前 還會把PBST洗好的膜（10min/次 共4次）放在冰箱4度1h左右 （嘗試是不是因?yàn)槟さ臏囟冗^高而影響ECL液的酶促反應(yīng)） 4PS. 做膠的技術(shù)應(yīng)該不會出現(xiàn)問題 跑膠正常 嗅酚藍(lán)剛漂停止跑膠（marker清晰可見 水平 ） 轉(zhuǎn)膜沒有4度的條件 就用的預(yù)冷的trans buffer轉(zhuǎn)膜 轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜上marker也清晰可見 膜與膠之間沒有氣泡 感覺該做的都做了 該小心的都小心了 可是曝光的時(shí)候總是大片白片出現(xiàn) 運(yùn)氣好的話可能會出現(xiàn)某一張膜有條帶 其他膜白片 或者是熒光一下子就淬滅的情況 請教各位高手 不勝感激 [ Last edited by 殺生丸殿下_q on 2013-7-5 at 22:38 ] |
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zhouking8758
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cicelyzh
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| 你是說實(shí)驗(yàn)室溫度非常高嗎？一般的western孵育在室溫下進(jìn)行就可以了，4°C下抗原抗原結(jié)合以及酶促反應(yīng)都會變慢。一抗一般4°C過夜沒有什么，因?yàn)榉跤龝r(shí)間比較長。二抗都是做室溫1-2h就可以了，放在4°C做適當(dāng)延長時(shí)間也是可以的。至于為什么你的western失敗，我想可能有其它原因。你的ECL是否過期失效了？ |
2樓2013-07-06 00:56:19
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| 你說溫度熱，你那邊大概多少度，我這邊30多度在外面1各半小時(shí)，沒有什么問題，還有在試驗(yàn)過程中，可以染下膜看看轉(zhuǎn)移效果，做的時(shí)候加一個(gè)內(nèi)參看看，不過我想這些應(yīng)該不是做不出來的原因，你看你的一些東西有沒有不好用，如樓上的發(fā)光液等一些試劑 |
3樓2013-07-06 10:37:14
殺生丸殿下_q
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實(shí)驗(yàn)室一直開著空調(diào) 就是門總開 外界溫度應(yīng)該不會特別高 25-30度左右吧 你們說的東西壞 的確有可能 可是已經(jīng)想不出來哪里有東西壞了 因?yàn)槟z 緩沖液 發(fā)光液 都是重新配置的了 但是 ECL確實(shí)是還是會讓人心存疑慮 因?yàn)橛型瑢W(xué)發(fā)現(xiàn)把膜傾入ECL是有條帶的 但是一拿出來 還沒來及拿膠片 熒光瞬間淬滅 也有曝光比如12個(gè)樣品 特別悲催的只能出現(xiàn)10個(gè)孔的條帶 因?yàn)槠渲杏心敲?個(gè) 2個(gè)立刻淬滅掉了的情況 可是用了BD試用裝的ECL似乎這個(gè)問題也不能夠緩解 總之 曝光這個(gè)環(huán)節(jié)特別怪異 要么全部白片 要么瞬間淬滅 實(shí)在是搞不明白究竟發(fā)生了什么 |
4樓2013-07-06 16:08:08
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