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dingj1988銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
求助關(guān)于PCR相關(guān)問(wèn)題！
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各位前輩： 大家好，請(qǐng)教個(gè)有關(guān)PCR相關(guān)問(wèn)題！ 本人是學(xué)藥化專(zhuān)業(yè)的，對(duì)生物了解的不太多！但是現(xiàn)在的工作是QC部門(mén)的，有一部分工作是做公司產(chǎn)品檢測(cè)。 最近做公司產(chǎn)品出產(chǎn)前要通過(guò)PCR檢測(cè)其有無(wú)HIV,HCV，用的是深圳凱杰生物制品有限公司的試劑盒，產(chǎn)品是激素類(lèi)生化產(chǎn)品，操作都是按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)樣品前處理的，結(jié)果是到最后幾個(gè)樣品出現(xiàn)“抬頭”跡象，而且空白對(duì)照也有“抬頭跡象”，不知是哪里污染了。之前別人做的都是正常的，按說(shuō)就算我的樣品處理過(guò)程中污染了，那么空白就是加酶和反應(yīng)液和水直接反應(yīng)應(yīng)該不會(huì)有污染的呀！試驗(yàn)中用到的槍和槍頭什么的都是專(zhuān)用的， 這幾天在排查原因也沒(méi)頭緒，好郁悶，忘各位前輩們大俠們提點(diǎn)好的建議，比較著急或是有什么好的推薦的資料何以推薦一下的，拜謝各位了！ |
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抱歉 因出差沒(méi)有上網(wǎng) 今天才看到 一般熒光定量PCR在30個(gè)循環(huán)之后的才出現(xiàn)的產(chǎn)物我們都認(rèn)為是沒(méi)有意義的，但是如果你經(jīng)常出現(xiàn)也應(yīng)該引起重視，我指的溶解曲線就是melting curve，是用來(lái)分析產(chǎn)物專(zhuān)一性的，所有熒光定量PCR程序最后都應(yīng)該有這一步，我的意思是說(shuō)，你的產(chǎn)物的溶解曲線是不是與試劑盒中陽(yáng)性對(duì)照的溶解曲線在同一位置起峰，如果是，就說(shuō)明是同一個(gè)產(chǎn)物，先判斷這一點(diǎn)。 |
4樓2013-07-31 16:23:42
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
dingj1988: 金幣+16, ★★★很有幫助, 謝謝這位大俠！ 2013-07-17 23:58:42
gyesang: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-07-18 22:07:27
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
dingj1988: 金幣+16, ★★★很有幫助, 謝謝這位大俠！ 2013-07-17 23:58:42
gyesang: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-07-18 22:07:27
| 你是指的熒光定量PCR嗎？這個(gè)過(guò)程靈敏度很高的，有假陽(yáng)性也正常，你首先看看“抬頭”的樣品的溶解曲線的峰的位置和陽(yáng)性對(duì)照（如果你做了的話）是不是相同，如果相同才證明是目的基因，如果不相同，而且空白對(duì)照也有，那就考慮引物是不是不太好，可能會(huì)出現(xiàn)非特異性的擴(kuò)增，換換引物試試。 |
2樓2013-07-17 21:01:23
dingj1988
銅蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 274.3
- 帖子: 68
- 在線: 64.6小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1153254
- 注冊(cè): 2010-11-22
- 專(zhuān)業(yè): 數(shù)論
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這位大俠，先感謝你給我回復(fù)！會(huì)給你送金幣的！ 我做的就是熒光定量PCR，之前和我交接的一個(gè)同事從四月份開(kāi)始做就有這種抬頭，之前一直都是正常的為陰性，我現(xiàn)在做的HCV,HIV在35 個(gè)循環(huán)之前都還是好的，但是到了35個(gè)循環(huán)后就開(kāi)始有點(diǎn)抬頭了，一般HIV設(shè)置40個(gè)循環(huán)最后五個(gè)循環(huán)會(huì)抬頭，HCV設(shè)置45個(gè)循環(huán)最后十個(gè)循環(huán)會(huì)有抬頭跡象 那你說(shuō)的所謂抬頭“抬頭”的樣品的溶解曲線的峰的位置和陽(yáng)性對(duì)照（如果你做了的話）是不是相同，是指的是試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照嗎？峰的位置具體是指什么位置呢？本人愚鈍不太明白，還望不吝賜教！每次都會(huì)做陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線的！引物是試劑盒自帶的，一般都在有效期內(nèi)使用的！ 謝謝，麻煩了！ |
3樓2013-07-17 23:55:32
匿名
用戶注銷(xiāo) (著名寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 12 (小學(xué)生)
- 金幣: 673.9
- 散金: 3519
- 紅花: 31
- 帖子: 2270
- 在線: 259.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 0
- 注冊(cè): 2010-07-13
- 專(zhuān)業(yè): 西方哲學(xué)史
5樓2013-07-31 19:31:37
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