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[交流]
BL21同源轉(zhuǎn)化 已有4人參與
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大家好，我最近在做BL21的同學轉(zhuǎn)化，我想插入一個基因到BL21的chromosome里面，但是我一直都不成功，我是用氯霉素作為antibiotic resistance gene在我要插入的基因之后，我用的是PKD46質(zhì)粒的，然后我有幾個疑問， 第一就是pKD46的induction OD point。 第二個是是否要降低氯霉素的濃度，氯霉素很用以引起自身的變異。 第三個是 我的 PCR targeting product的大小是4.9KB，其中同源壁的長度是200bp，is that sufficient? 第四個是這個BL21 strain, 其中recA基因已經(jīng)被knocked out， 這個會不會影響到轉(zhuǎn)化？ 第五個是induce 的時常，有人和我說他induce之后是看時間的，比如3個小時，但是那個時候可能OD已經(jīng)是0.8，這時候在做competent cell會不會有點老了？ 我總是被告知做B系列的很難，我想問下這里有沒有成功的同學或者正在努力的同學共同討論分享下經(jīng)驗。 謝謝 |
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沒做過B系列 不過pkd46這個用的pbad promoter可能不如psim系列的PL+CI857好 induction@OD=0.1（略小也沒關(guān)系，但我覺得不要太晚） clora是比較難做得，不過長出來的基本一定是對的，（控制在5-10ug/ml） 4.9kb很大，在K系列里面我同實驗室的用psim19做大片段，一次大概就1-2個陽性 recA沒看出有關(guān)系，反正我操作克隆菌株時候感覺效率還高點（可能和endA有關(guān)） 3h太時間太長了，pbad大概1h，OD0.3-0.4比較好，psim的PL大概15min就夠了（不過B系列不知道） http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1626079/#!po=25.0000 這個文章試了些不同條件，不過我對他們實驗有點懷疑。。 |
2樓2013-07-21 08:20:38
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3樓2013-07-21 10:03:43
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5樓2014-04-23 11:19:32
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