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[交流]
BL21同源轉(zhuǎn)化 已有4人參與
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大家好，我最近在做BL21的同學(xué)轉(zhuǎn)化，我想插入一個基因到BL21的chromosome里面，但是我一直都不成功，我是用氯霉素作為antibiotic resistance gene在我要插入的基因之后，我用的是PKD46質(zhì)粒的，然后我有幾個疑問， 第一就是pKD46的induction OD point。 第二個是是否要降低氯霉素的濃度，氯霉素很用以引起自身的變異。 第三個是 我的 PCR targeting product的大小是4.9KB，其中同源壁的長度是200bp，is that sufficient? 第四個是這個BL21 strain, 其中recA基因已經(jīng)被knocked out， 這個會不會影響到轉(zhuǎn)化？ 第五個是induce 的時常，有人和我說他induce之后是看時間的，比如3個小時，但是那個時候可能OD已經(jīng)是0.8，這時候在做competent cell會不會有點(diǎn)老了？ 我總是被告知做B系列的很難，我想問下這里有沒有成功的同學(xué)或者正在努力的同學(xué)共同討論分享下經(jīng)驗(yàn)。 謝謝 |
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hb467116237
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5樓2014-04-23 11:19:32
Haibara_Ai
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沒做過B系列 不過pkd46這個用的pbad promoter可能不如psim系列的PL+CI857好 induction@OD=0.1（略小也沒關(guān)系，但我覺得不要太晚） clora是比較難做得，不過長出來的基本一定是對的，（控制在5-10ug/ml） 4.9kb很大，在K系列里面我同實(shí)驗(yàn)室的用psim19做大片段，一次大概就1-2個陽性 recA沒看出有關(guān)系，反正我操作克隆菌株時候感覺效率還高點(diǎn)（可能和endA有關(guān)） 3h太時間太長了，pbad大概1h，OD0.3-0.4比較好，psim的PL大概15min就夠了（不過B系列不知道） http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1626079/#!po=25.0000 這個文章試了些不同條件，不過我對他們實(shí)驗(yàn)有點(diǎn)懷疑。。 |
2樓2013-07-21 08:20:38
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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3樓2013-07-21 10:03:43
huainianshili
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4樓2013-07-23 16:42:18
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