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[求助] 氨氧化細(xì)菌PCR結(jié)果已有1人參與

求教諸位大神，我做的安氧化細(xì)菌，PCR的結(jié)果有很明顯的非特異性擴(kuò)增，根據(jù)計(jì)算退火溫度應(yīng)該子啊54到56度之間，我做了55,56,57，結(jié)果都有非特異性擴(kuò)增，56度的結(jié)果還很明顯，不知道有沒有人遇到過這種情況，用的引物是amoA1F和amoA2R。我要做克隆，可不可以忽略非特異性擴(kuò)增，直接切我的目的片段？

退火溫度562013-07-23 13hr 00min.jpg

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1樓 2013-07-23 15:03:57

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9樓: Originally posted by 秋之靜美 at 2014-07-30 10:24:55
你好，你的氨氧化細(xì)菌PCR條件摸好了嗎？我也再做，同求

...

按這個(gè)條件，還是有非特異性擴(kuò)增，只能割膠純化，做克隆還是可以的

氨氧化細(xì)菌PCR條件.jpg

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10樓2014-08-05 22:12:29

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

建議樓主繼續(xù)提高退火溫度，看特異性是否會(huì)消失。直接切應(yīng)該也是可以的，但是個(gè)人感覺樓主的膠應(yīng)該不好切下來(lái)。。。

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只要路是對(duì)的，就不怕路遠(yuǎn)．

2樓2013-07-23 15:17:33

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2樓: Originally posted by wwb95599 at 2013-07-23 15:17:33
建議樓主繼續(xù)提高退火溫度，看特異性是否會(huì)消失。直接切應(yīng)該也是可以的，但是個(gè)人感覺樓主的膠應(yīng)該不好切下來(lái)。。。

一般退火溫度可以提高到什么程度呢？

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3樓2013-07-23 18:55:53

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【答案】應(yīng)助回帖

引用回帖:

3樓: Originally posted by zx1990 at 2013-07-23 18:55:53
一般退火溫度可以提高到什么程度呢？...

做一個(gè)梯度，上下１０度都可以，剛開始設(shè)計(jì)時(shí)候可以給溫度梯度設(shè)計(jì)的稍微大些，然后再縮少也可以．
不過樓主要先確定引物設(shè)計(jì)是否正確，建議先BLAST下．

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只要路是對(duì)的，就不怕路遠(yuǎn)．

4樓2013-07-26 17:05:18

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4樓: Originally posted by wwb95599 at 2013-07-26 17:05:18
做一個(gè)梯度，上下１０度都可以，剛開始設(shè)計(jì)時(shí)候可以給溫度梯度設(shè)計(jì)的稍微大些，然后再縮少也可以．
不過樓主要先確定引物設(shè)計(jì)是否正確，建議先BLAST下．...

可否告知具體如何操作才能確定引物正確與否？

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5樓2013-07-27 09:29:06

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Sthunder

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【答案】應(yīng)助回帖

PCR可以采用兩步，也就是說退火延伸一起進(jìn)行。至于你的實(shí)驗(yàn)，我看你兩條帶亮度差不多，所以我估計(jì)很難通過提高退火溫度來(lái)消除非特異條帶。不過你完全可以直接回收目的條帶進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，由于兩條帶大小差異不大，所以建議跑2%的膠，如果還分不清的話，切膠的時(shí)候小心，并跳去克隆是做個(gè)PCR，看看大小，記得做對(duì)照。Good luck！

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互助互勵(lì)，共奮共進(jìn)��！

6樓2013-07-27 11:17:45

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6樓: Originally posted by Sthunder at 2013-07-27 11:17:45
PCR可以采用兩步，也就是說退火延伸一起進(jìn)行。至于你的實(shí)驗(yàn)，我看你兩條帶亮度差不多，所以我估計(jì)很難通過提高退火溫度來(lái)消除非特異條帶。不過你完全可以直接回收目的條帶進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，由于兩條帶大小差異不大，所 ...

嗯，我也是這樣做的，結(jié)果回收的目標(biāo)條帶濃度很低，沒辦法做后續(xù)的克隆，傷心欲絕，我覺得PCR欺騙了我，明明做20ul體系條帶挺亮的，結(jié)果做到40ul就不亮了

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7樓2013-07-28 07:57:23

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swach

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樓主，你好，我現(xiàn)在也要做氨氧化細(xì)菌，引物和你選擇的一樣。不知道你用的反應(yīng)條件是什么？可以給我分享下嗎？我用文獻(xiàn)中的條件進(jìn)行PCR，也出現(xiàn)了兩條條帶。PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度應(yīng)該是490bp吧，謝謝樓主。

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8樓2014-07-08 18:23:52

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8樓: Originally posted by swach at 2014-07-08 18:23:52
樓主，你好，我現(xiàn)在也要做氨氧化細(xì)菌，引物和你選擇的一樣。不知道你用的反應(yīng)條件是什么？可以給我分享下嗎？我用文獻(xiàn)中的條件進(jìn)行PCR，也出現(xiàn)了兩條條帶。PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度應(yīng)該是490bp吧，謝謝樓主。

你好，你的氨氧化細(xì)菌PCR條件摸好了嗎？我也再做，同求

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9樓2014-07-30 10:24:55

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