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[求助]
ni柱純化問題 已有1人參與
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大家好，我最近用金斯瑞的Ni柱純化我的蛋白（帶His6），上樣過程會(huì)穿過挺多，吸附也較弱（說明書上的緩沖液 Lysis Equilibration Buffer (LE buffer): 50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, pH 8.0 Wash Buffer: 50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0 Elution buffer: 50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0 就是用10mM咪唑洗雜，我用10mM咪唑基本洗脫了），想問大家，Ni柱有哪些上樣方式，可以把柱材和我樣品混勻過夜，第二天裝柱嗎？大家平時(shí)還用什么緩沖液效果好，謝謝大家 |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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25樓2013-08-15 16:36:48
zhang1zheng2
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2樓2013-08-06 11:19:33
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4樓2013-08-06 15:30:02
bullfrog325
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7樓2013-08-06 21:03:24
【答案】應(yīng)助回帖
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你可以試一下降低氯化鈉濃度，我過NI的時(shí)候是用20mM Tris-HCl 150mM NaCl平衡的 每1ml可吸附20mg蛋白，這個(gè)不一定，而且要看總蛋白，你可以試一下你的離子柱下樣后的樣品再蛋白質(zhì)核酸檢測(cè)器的吸收值，然后上Q柱子，當(dāng)流穿的顯示值是離子下樣的一半的時(shí)候換平衡液，這樣可以大概測(cè)一下Ni對(duì)你的蛋白的載量。 至于柱材和我樣品混勻過夜個(gè)人覺得沒有什么意義，應(yīng)該一樣的，不會(huì)因?yàn)檫@個(gè)時(shí)間長(zhǎng)結(jié)合牢固 |
8樓2013-08-06 23:19:43
xuexie
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【答案】應(yīng)助回帖
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| 我做的也是金斯瑞的鎳柱，用的是0.02M Tris-Hcl+0.25M Nacl平衡后高鹽除雜。同學(xué)也遇到過一樣不掛柱的問題，重復(fù)幾次后懷疑是由于HIS標(biāo)簽被蛋白包裹，沒有暴露，所以無法充分掛柱。你可以用1.5mlEP管，裝一些填料在柱下試驗(yàn)，同樣用緩沖液平衡后上樣，充分混勻后離心，再用EDTA洗脫，這樣試驗(yàn)會(huì)節(jié)省時(shí)間。希望對(duì)你有幫助 |
9樓2013-08-12 16:15:29
10樓2013-08-14 11:17:40
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