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[求助]
乳桿菌基因組PCR結(jié)果未得到目的基因
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我是采用AxyPrep細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒從一種乳桿菌中提基因組， 提了4次，最好的一次條帶很淺，結(jié)果如圖Lb DNA。 然后根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)引物，引物中F的TM值為65.3，R的TM值為68.1， PCR條件為：ddH2O 8.2ul 引物F 0.6ul 引物R 0.6ul 基因組 0.6ul Primer STAR 10ul 設(shè)置的退火溫度為55度，15s 跑出來(lái)的圖有很多非特異性條帶，無(wú)特別亮的條帶。 我要的目的基因大小是750bp的，但這些條帶中找不到，跪求各位大神幫我分析下 |
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2013-08-07 11:47:23, 14.88 K
2013-08-07 11:54:25, 19.12 K
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
~小綠~: 金幣+2, ★★★很有幫助 2013-08-07 12:37:10
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致 2013-7-20 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶，其原因與對(duì)策如下：一．引物與靶序列不完全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。對(duì)策：重新設(shè)計(jì)引物。二．Mg2+ 離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物；減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶；降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度。三．靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因： 1.整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)。這種非特異性帶出現(xiàn)可用以下方法解決：（1）在加樣槍的接頭和吸桿之間加上脫脂消毒棉花，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。（2）除了酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。（3）所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。（4）重新提取模板DNA。2.空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有時(shí)候可能會(huì)互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)的產(chǎn)生。雖然這樣的可能性比較小。對(duì)策：實(shí)驗(yàn)前對(duì)實(shí)驗(yàn)室充分通風(fēng)，試驗(yàn)時(shí)盡量加上PCR試劑暴露于空氣中的時(shí)間，還可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除空氣中的小片段核酸造成的污染，最基本的解決辦法：重新提取模板DNA。 考慮使用熱啟動(dòng)模式�？梢再�(gòu)買商用的PCR熱啟動(dòng)酶，也可以用石蠟隔離模式。 調(diào)整變性和退火溫度時(shí)間。 更換所有緩沖溶液，使用全部新配的緩沖溶液。這點(diǎn)可能太基本了，很不被重視。 適當(dāng)調(diào)高復(fù)性溫度。沒(méi)有重新設(shè)計(jì)引物，不要大范圍地變動(dòng)反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動(dòng)。如果出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，則把在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把復(fù)性溫度提高1-3度；如果出現(xiàn)任何擴(kuò)增帶，則把在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把復(fù)性溫度降低1-3度。 更換DNA聚合酶，酶量不要太大，以免出現(xiàn)特異性擴(kuò)增�？梢约尤敕磻�(yīng)體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油。 使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，非特異性擴(kuò)增較多，這時(shí)，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然后每隔1個(gè)循環(huán)，退火溫度降低1-2度，直至到達(dá)正常的Tm附近的退火溫度。 適當(dāng)減低的dNTP的濃度，可以分梯度進(jìn)行。 一般的調(diào)整順序（不是絕對(duì)的）：若PCR反應(yīng)后無(wú)任何產(chǎn)物，可先調(diào)整Mg2+ 濃度，Mg2+ 濃度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，調(diào)整時(shí)從低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 濃度為1.5mmol/L。同時(shí)全部重新配所有的緩沖溶液。 然后調(diào)整引物濃度，在調(diào)整引物與模板的結(jié)合溫度，調(diào)整變性和退火溫度時(shí)間。接著或者與引物調(diào)整同時(shí)，把酶換成其他類型的DNA聚合酶（高保真酶或者熱啟動(dòng)酶）。再往后，檢測(cè)和重新提取DNA模板（包括用質(zhì)譜或者電泳檢測(cè)DNA是否變短，清除酚和SDS，檢測(cè)模板濃度，必要時(shí)要對(duì)DNA模板測(cè)序）。再往后和使用梯度降低dNTP。最后這些都做了仍未奏效，那么就要重新設(shè)計(jì)引物了。一般是最先調(diào)整Mg2+ 濃度，最后重新設(shè)計(jì)引物，其他順序可變。 過(guò)去，我也回答過(guò)PCR非特異性擴(kuò)增的問(wèn)題，但是這次回答我在2013年7月20日重新編輯核對(duì)的 |
2樓2013-08-07 12:01:09
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3樓2013-08-07 12:06:07
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我在3樓的回答參考了yujitianqing的帖子，http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6198669 過(guò)去我沒(méi)有注意到，而后我去查閱了文獻(xiàn)，與yujitianqing的帖子的內(nèi)容基本上一致。 |
4樓2013-08-07 12:10:37
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更正2樓和3樓：調(diào)整鎂離子濃度時(shí)，可以與dNTP正相關(guān)的梯度調(diào)整，兩者同方向分梯度調(diào)節(jié)，一般不要反方向調(diào)節(jié)；但是可以單獨(dú)鎂離子濃度，而dNTP濃度之一不動(dòng)；有時(shí)候dNTP濃度調(diào)整不大時(shí)也可以不動(dòng)鎂離子濃度，因?yàn)殒V離子濃度太高了，可能會(huì)增加非特異性擴(kuò)增。 我參考了yujitianqing的帖子，http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6198669 過(guò)去我沒(méi)有注意到，而后我去查閱了文獻(xiàn)，有的文獻(xiàn)與yujitianqing的帖子的內(nèi)容基本上一致，也有些文獻(xiàn)與yujitianqing的帖子的內(nèi)容不一致。 |
5樓2013-08-07 12:17:19
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6樓2013-08-07 12:22:14
7樓2013-08-07 12:25:50
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【答案】應(yīng)助回帖
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1.商品酶也可以自己加減鎂離子濃度，加不用說(shuō)了，減少用超濾離心即可，順便去掉些甘油。 2.還是不行，就使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，非特異性擴(kuò)增較多，這時(shí)，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然后每隔1個(gè)循環(huán)，退火溫度降低1-2度，直至到達(dá)正常的Tm附近的退火溫度。梯度降低PCR除了基因組DNA為模板外，一般的非基因組的DNA為模板也可以。我原來(lái)的帖子此處也有錯(cuò)，這里更正過(guò)來(lái)。 3.還可以使用巢式PCR。 4.最后，可以換做高忠實(shí)性的DNA復(fù)制酶，有現(xiàn)成很多種商品可以選擇。 |
8樓2013-08-07 12:32:55
9樓2013-08-07 12:36:46
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