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[求助]
乳桿菌基因組PCR結(jié)果未得到目的基因
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我是采用AxyPrep細菌基因組DNA小量提取試劑盒從一種乳桿菌中提基因組， 提了4次，最好的一次條帶很淺，結(jié)果如圖Lb DNA。 然后根據(jù)目的基因設(shè)計引物，引物中F的TM值為65.3，R的TM值為68.1， PCR條件為：ddH2O 8.2ul 引物F 0.6ul 引物R 0.6ul 基因組 0.6ul Primer STAR 10ul 設(shè)置的退火溫度為55度，15s 跑出來的圖有很多非特異性條帶，無特別亮的條帶。 我要的目的基因大小是750bp的，但這些條帶中找不到，跪求各位大神幫我分析下 |
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- 附件 2 : Lb-PCR.jpg
2013-08-07 11:47:23, 14.88 K
2013-08-07 11:54:25, 19.12 K
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 核酸生物學(xué)實驗經(jīng)驗 |
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9樓2013-08-07 12:36:46
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
~小綠~: 金幣+2, ★★★很有幫助 2013-08-07 12:37:10
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
~小綠~: 金幣+2, ★★★很有幫助 2013-08-07 12:37:10
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PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致 2013-7-20 PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶，其原因與對策如下：一．引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體。對策：重新設(shè)計引物。二．Mg2+ 離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設(shè)計引物；減低酶量或調(diào)換另一來源的酶；降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度。三．靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因： 1.整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)。這種非特異性帶出現(xiàn)可用以下方法解決：（1）在加樣槍的接頭和吸桿之間加上脫脂消毒棉花，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。（2）除了酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。（3）所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。（4）重新提取模板DNA。2.空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有時候可能會互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)的產(chǎn)生。雖然這樣的可能性比較小。對策：實驗前對實驗室充分通風(fēng)，試驗時盡量加上PCR試劑暴露于空氣中的時間，還可用巢式PCR方法來減輕或消除空氣中的小片段核酸造成的污染，最基本的解決辦法：重新提取模板DNA。 考慮使用熱啟動模式�？梢再徺I商用的PCR熱啟動酶，也可以用石蠟隔離模式。 調(diào)整變性和退火溫度時間。 更換所有緩沖溶液，使用全部新配的緩沖溶液。這點可能太基本了，很不被重視。 適當(dāng)調(diào)高復(fù)性溫度。沒有重新設(shè)計引物，不要大范圍地變動反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動。如果出現(xiàn)非特異性擴增，則把在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把復(fù)性溫度提高1-3度；如果出現(xiàn)任何擴增帶，則把在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把復(fù)性溫度降低1-3度。 更換DNA聚合酶，酶量不要太大，以免出現(xiàn)特異性擴增。可以加入反應(yīng)體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油。 使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進行PCR擴增時，非特異性擴增較多，這時，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然后每隔1個循環(huán)，退火溫度降低1-2度，直至到達正常的Tm附近的退火溫度。 適當(dāng)減低的dNTP的濃度，可以分梯度進行。 一般的調(diào)整順序（不是絕對的）：若PCR反應(yīng)后無任何產(chǎn)物，可先調(diào)整Mg2+ 濃度，Mg2+ 濃度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，調(diào)整時從低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 濃度為1.5mmol/L。同時全部重新配所有的緩沖溶液。 然后調(diào)整引物濃度，在調(diào)整引物與模板的結(jié)合溫度，調(diào)整變性和退火溫度時間。接著或者與引物調(diào)整同時，把酶換成其他類型的DNA聚合酶（高保真酶或者熱啟動酶）。再往后，檢測和重新提取DNA模板（包括用質(zhì)譜或者電泳檢測DNA是否變短，清除酚和SDS，檢測模板濃度，必要時要對DNA模板測序）。再往后和使用梯度降低dNTP。最后這些都做了仍未奏效，那么就要重新設(shè)計引物了。一般是最先調(diào)整Mg2+ 濃度，最后重新設(shè)計引物，其他順序可變。 過去，我也回答過PCR非特異性擴增的問題，但是這次回答我在2013年7月20日重新編輯核對的 |
2樓2013-08-07 12:01:09
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我在3樓的回答參考了yujitianqing的帖子，http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6198669 過去我沒有注意到，而后我去查閱了文獻，與yujitianqing的帖子的內(nèi)容基本上一致。 |
4樓2013-08-07 12:10:37
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