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單單VS雙雙新蟲 (初入文壇)
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[交流]
雙順反子 表達(dá)載體的構(gòu)建——求助！
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正在構(gòu)建雙順反子表達(dá)載體，用的是pet-32a 有幾個(gè)問題請(qǐng)教高人指點(diǎn) 1、第一個(gè)基因需不需要ATG還是直接用成熟肽，終止密碼子需不需要去掉； 2、第二個(gè)基因之前除了要加RBS序列還需要添加別的序列嗎，ATG是否需要帶著；3、第二個(gè)基因從哪里開始編碼是否RBS會(huì)被識(shí)別成三聯(lián)密碼子翻譯成相應(yīng)氨基酸； 4、第二個(gè)基因不加RBS，第一個(gè)基因不加終止密碼子，是否會(huì)使兩條多肽串聯(lián)起來，這樣形式的蛋白經(jīng)過變性復(fù)性能否具有相應(yīng)的生物學(xué)活性（兩個(gè)多肽，是同一蛋白的兩個(gè)亞單位） |
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2. 用不用強(qiáng)啟動(dòng)子和需不需要RBS有毛線關(guān)系。 啟動(dòng)子只控制轉(zhuǎn)錄，核糖體結(jié)合位點(diǎn)是必須的，關(guān)于連續(xù)的bicistron 表達(dá)具體可以參考以下三篇文章。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23474465 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23034349 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22983090 結(jié)論就是，如果使用E coli本身啟動(dòng)子，那么第二個(gè)CDS翻譯強(qiáng)度首先會(huì)隨著距起始位點(diǎn)變遠(yuǎn)而下降（當(dāng)然在使用T7 RNAP時(shí)候，在2-3Kbp以內(nèi)可能不是很明顯） 如果第一段CDS的stop codon 出現(xiàn)在RBS后面，那么第一個(gè)CDS的翻譯會(huì)幫助解除mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而幫助第二個(gè)cistron的翻譯(強(qiáng)度只取決于RBS的序列，和第二個(gè)CDS的起始部分無關(guān)，沒有RBS幾乎不翻譯) 如果第一段CDS的Stop codon在第二個(gè)RBS之前，那么第二個(gè)CDS的翻譯很不好預(yù)測(cè)，可以通過RBS二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行一些分析，不過準(zhǔn)確率大概就50%（具體看 http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n10/full/nbt.1568.html ） 所以此時(shí)如果想有效的去除5‘sequence 對(duì)第二個(gè)cistron的影響，可以使用我上面提到的第二 三篇文章的方法，當(dāng)然最簡單的方法就是再克隆一遍啟動(dòng)子往后的序列，這樣最保險(xiǎn)。 |
6樓2013-08-28 12:49:21
cicelyzh
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1. 如果你指向表達(dá)成熟肽，可以去掉原序列里的信號(hào)肽編碼序列，但是需要有ATG作為起始密碼子。這樣表達(dá)出來的產(chǎn)物比成熟肽多一個(gè)Met。如果你不想把兩個(gè)基因融合表達(dá)，就不要去掉第一個(gè)序列的終止密碼子。 2. 第二個(gè)基因之前不用加核糖體結(jié)合位點(diǎn)。pet-32a用的是強(qiáng)啟動(dòng)子，沒有終止子序列的情況下核糖體不會(huì)脫落。第二個(gè)基因的ATG需要保留，第二個(gè)基因就是從其ATG開設(shè)表達(dá)。 3. 兩個(gè)序列之間不用保持閱讀框，除非你想做成融合蛋白。 3. 融合蛋白是否保留原來的活性的確要看是否正確折疊成獨(dú)立結(jié)構(gòu)，一般會(huì)在兩個(gè)蛋白之間加linker。 |
2樓2013-08-28 02:29:54
單單VS雙雙
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感謝老師幫助，受益匪淺，還有幾個(gè)地方不太明白 1、第一個(gè)基因的翻譯起始位點(diǎn)應(yīng)該是載體RBS下游的第一個(gè)ATG吧，也就是說在表達(dá)我目的片段的氨基酸之前還要表達(dá)載體上的氨基酸100多個(gè)，這樣的話我第一個(gè)基因添加ATG的作用是什么呢，第一個(gè)基因表達(dá)出來的蛋白是不是就是各種Tag 加上我的目的蛋白的融合蛋白？ 2、載體兩翼都有His.tag有沒有必要都保留？ 3、第一個(gè)基因如果帶著終止密碼子，第二個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯會(huì)不會(huì)受到影響？第二個(gè)基因我可以用TAA做終止密碼子，不讓下游His.tag 表達(dá)嗎？ |
3樓2013-08-28 10:18:26
cicelyzh
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1. 你可以選擇不同的酶切位點(diǎn)克隆來實(shí)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物帶什么tag。pET-32a的確可以在N端融合多個(gè)tag，并且這些tag是可以在純化后切除的。這種情況，你實(shí)際上是先表達(dá)出帶標(biāo)簽的融合蛋白，所以第一個(gè)目的基因的ATG可以不要，但要注意序列的閱讀框與前面的融合標(biāo)簽相符，避免移碼。 2. his-tag留一個(gè)就可以了。載體這樣設(shè)計(jì)是為了克隆方便。有些蛋白的N端或者C端對(duì)活性很重要，只有一邊的標(biāo)簽純化出來的蛋白有活性。 3. 第一個(gè)基因的終止密碼子不會(huì)影響第二個(gè)基因的表達(dá)，有終止密碼子可以避免形成融合蛋白。當(dāng)然如果你想做融合表達(dá)的話，應(yīng)該去掉第一個(gè)基因的終止密碼子。第二個(gè)基因的TAA如果保留，表達(dá)出來的蛋白的C端是沒有his-tag。 |
4樓2013-08-28 11:40:12
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