 |
 |
 |
| 24小時(shí)熱門(mén)版塊排行榜 |
- >論壇更新日志 (5873)
- >考研 (2902)
- >導(dǎo)師招生 (2689)
- >文獻(xiàn)求助 (491)
- >蟲(chóng)友互識(shí) (422)
- >碩博家園 (267)
- >考博 (169)
- >招聘信息布告欄 (153)
- >博后之家 (106)
- >休閑灌水 (98)
- >論文投稿 (89)
- >綠色求助(高懸賞) (62)
- >基金申請(qǐng) (55)
- >找工作 (48)
- >藥學(xué) (36)
- >SciFinder/Reaxys (34)
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 9 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 5318 | 回復(fù): 8 | ||||||
[交流]
雙順?lè)醋?表達(dá)載體的構(gòu)建——求助！
|
|
正在構(gòu)建雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體，用的是pet-32a 有幾個(gè)問(wèn)題請(qǐng)教高人指點(diǎn) 1、第一個(gè)基因需不需要ATG還是直接用成熟肽，終止密碼子需不需要去掉； 2、第二個(gè)基因之前除了要加RBS序列還需要添加別的序列嗎，ATG是否需要帶著；3、第二個(gè)基因從哪里開(kāi)始編碼是否RBS會(huì)被識(shí)別成三聯(lián)密碼子翻譯成相應(yīng)氨基酸； 4、第二個(gè)基因不加RBS，第一個(gè)基因不加終止密碼子，是否會(huì)使兩條多肽串聯(lián)起來(lái)，這樣形式的蛋白經(jīng)過(guò)變性復(fù)性能否具有相應(yīng)的生物學(xué)活性（兩個(gè)多肽，是同一蛋白的兩個(gè)亞單位） |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專(zhuān)輯推薦
 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | 藥學(xué)科研資料 | 核酸方面 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有211人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專(zhuān)業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
湖北師范大學(xué)招調(diào)劑啦
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- pMD18-T載體連接了目的片段后雙酶切鑒定出現(xiàn)了好多條帶 怎么回事?
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 組氨酸標(biāo)簽的問(wèn)題
已經(jīng)有27人回復(fù)
- 一條成熟mRNA可否翻譯兩條蛋白？
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 【求助/交流】表達(dá)載體pCAMBIA1304表達(dá)順序看不懂
已經(jīng)有12人回復(fù)
- micro ? small ? short ? RNA
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后,提取的質(zhì)粒和原來(lái)不一樣了啊
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 【求助/交流】大腸桿菌有的是表達(dá)載體的宿主，有些事克隆載體的宿主，他們的區(qū)別在哪?/a>
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【求助/交流】PET32a 表達(dá)載體和PMD19-T 克隆載體，是否可以用之前養(yǎng)在DH5a里擴(kuò)增？
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 【求助/交流】真核細(xì)胞到底是單順?lè)醋舆�是多順?lè)醋�？？�?/a>
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 【求助/交流】目的基因連接表達(dá)載體后涂板不長(zhǎng)菌
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 【求助/交流】什么是組成型表達(dá)載體
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】釀酒酵母表達(dá)載體的構(gòu)建問(wèn)題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】在構(gòu)建基因表達(dá)載體的時(shí)候什么時(shí)候需要人為地在上面加上啟動(dòng)子？
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】連接表達(dá)載體PET-28A失敗原因
已經(jīng)有23人回復(fù)
- 【求助/交流】原核表達(dá)載體pGEX-4T-1對(duì)應(yīng)的表達(dá)菌株
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】釀酒酵母真核表達(dá)載體構(gòu)建和連接的問(wèn)題
已經(jīng)有6人回復(fù)
» 搶金幣啦！回帖就可以得到:
-
【強(qiáng)推｜可留校】濟(jì)南大學(xué)博士后招聘（水利工程/鐵錳碳環(huán)境過(guò)程）
+1/280
-
【招聘】溫州醫(yī)科大學(xué)/附屬醫(yī)院/甌江實(shí)驗(yàn)室李校堃院士團(tuán)隊(duì)誠(chéng)聘博士后和科研人員
+1/188
-
歡迎加入贛南師范大學(xué)智能制造與未來(lái)能源學(xué)院
+2/68
-
青島大學(xué)固態(tài)電池研究團(tuán)隊(duì)招收材料、化學(xué)、物理等方向博士研究生
+2/40
-
湖北師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院招收調(diào)劑
+1/40
-
廣東省五邑大學(xué)光電催化團(tuán)隊(duì)接受研究生調(diào)劑
+1/34
-
浙江省人民醫(yī)院博士后崗位招聘
+1/33
-
浙江省人民醫(yī)院博士后崗位招聘
+1/31
-
上海工程技術(shù)大學(xué)李聰玲課題組招收調(diào)劑生
+1/12
-
西安工程大學(xué)能源化工新材料研發(fā)項(xiàng)目組接收2026年計(jì)算機(jī)類(lèi)調(diào)劑研究生
+1/9
-
江西水利電力大學(xué)08工學(xué)接收調(diào)劑
+1/8
-
山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 2026年碩士研究生擬接收調(diào)劑
+1/8
-
武漢紡織大學(xué)招收碩士研究生調(diào)劑 （社牛最好）
+1/4
-
青島大學(xué)化學(xué)工程（085602）與化學(xué)工程與技術(shù)（081700）招收大量調(diào)劑
+1/4
-
五邑大學(xué)紡織科學(xué)與工程學(xué)院“智能紡織材料與紡織品”研究團(tuán)隊(duì)接收碩士調(diào)劑生
+1/4
-
南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院柏惺峰課題組招收碩士研究生1名
+1/3
-
金屬材料先進(jìn)連接技術(shù)
+1/2
-
長(zhǎng)江師范學(xué)院化學(xué)工程方向接收大量調(diào)劑考生
+1/2
-
武漢紡織大學(xué)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室呂永鋼教授課題組招收材料、化學(xué)、生物相關(guān)專(zhuān)業(yè)碩士研究生
+1/1
-
調(diào)劑來(lái)這邊
+1/1
cicelyzh
鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
- MolEPI: 10
- 應(yīng)助: 1662 (講師)
- 金幣: 8693.8
- 帖子: 3516
- 在線: 456小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1614001
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
單單VS雙雙: 金幣+5 2013-08-28 10:19:09
myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-28 13:53:06
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
單單VS雙雙: 金幣+5 2013-08-28 10:19:09
myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-28 13:53:06
|
1. 如果你指向表達(dá)成熟肽，可以去掉原序列里的信號(hào)肽編碼序列，但是需要有ATG作為起始密碼子。這樣表達(dá)出來(lái)的產(chǎn)物比成熟肽多一個(gè)Met。如果你不想把兩個(gè)基因融合表達(dá)，就不要去掉第一個(gè)序列的終止密碼子。 2. 第二個(gè)基因之前不用加核糖體結(jié)合位點(diǎn)。pet-32a用的是強(qiáng)啟動(dòng)子，沒(méi)有終止子序列的情況下核糖體不會(huì)脫落。第二個(gè)基因的ATG需要保留，第二個(gè)基因就是從其ATG開(kāi)設(shè)表達(dá)。 3. 兩個(gè)序列之間不用保持閱讀框，除非你想做成融合蛋白。 3. 融合蛋白是否保留原來(lái)的活性的確要看是否正確折疊成獨(dú)立結(jié)構(gòu)，一般會(huì)在兩個(gè)蛋白之間加linker。 |
2樓2013-08-28 02:29:54
|
感謝老師幫助，受益匪淺，還有幾個(gè)地方不太明白 1、第一個(gè)基因的翻譯起始位點(diǎn)應(yīng)該是載體RBS下游的第一個(gè)ATG吧，也就是說(shuō)在表達(dá)我目的片段的氨基酸之前還要表達(dá)載體上的氨基酸100多個(gè)，這樣的話(huà)我第一個(gè)基因添加ATG的作用是什么呢，第一個(gè)基因表達(dá)出來(lái)的蛋白是不是就是各種Tag 加上我的目的蛋白的融合蛋白？ 2、載體兩翼都有His.tag有沒(méi)有必要都保留？ 3、第一個(gè)基因如果帶著終止密碼子，第二個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯會(huì)不會(huì)受到影響？第二個(gè)基因我可以用TAA做終止密碼子，不讓下游His.tag 表達(dá)嗎？ |
3樓2013-08-28 10:18:26
cicelyzh
鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
- MolEPI: 10
- 應(yīng)助: 1662 (講師)
- 金幣: 8693.8
- 帖子: 3516
- 在線: 456小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1614001
★ ★ ★
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-08-28 19:21:27
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-08-28 19:21:27
|
1. 你可以選擇不同的酶切位點(diǎn)克隆來(lái)實(shí)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物帶什么tag。pET-32a的確可以在N端融合多個(gè)tag，并且這些tag是可以在純化后切除的。這種情況，你實(shí)際上是先表達(dá)出帶標(biāo)簽的融合蛋白，所以第一個(gè)目的基因的ATG可以不要，但要注意序列的閱讀框與前面的融合標(biāo)簽相符，避免移碼。 2. his-tag留一個(gè)就可以了。載體這樣設(shè)計(jì)是為了克隆方便。有些蛋白的N端或者C端對(duì)活性很重要，只有一邊的標(biāo)簽純化出來(lái)的蛋白有活性。 3. 第一個(gè)基因的終止密碼子不會(huì)影響第二個(gè)基因的表達(dá)，有終止密碼子可以避免形成融合蛋白。當(dāng)然如果你想做融合表達(dá)的話(huà)，應(yīng)該去掉第一個(gè)基因的終止密碼子。第二個(gè)基因的TAA如果保留，表達(dá)出來(lái)的蛋白的C端是沒(méi)有his-tag。 |
4樓2013-08-28 11:40:12
5樓2013-08-28 12:38:24
Haibara_Ai
銅蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 57 (初中生)
- 金幣: 1896.7
- 帖子: 262
- 在線: 306.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2222431
★ ★
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-28 13:53:20
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-28 13:53:20
|
2. 用不用強(qiáng)啟動(dòng)子和需不需要RBS有毛線關(guān)系。 啟動(dòng)子只控制轉(zhuǎn)錄，核糖體結(jié)合位點(diǎn)是必須的，關(guān)于連續(xù)的bicistron 表達(dá)具體可以參考以下三篇文章。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23474465 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23034349 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22983090 結(jié)論就是，如果使用E coli本身啟動(dòng)子，那么第二個(gè)CDS翻譯強(qiáng)度首先會(huì)隨著距起始位點(diǎn)變遠(yuǎn)而下降（當(dāng)然在使用T7 RNAP時(shí)候，在2-3Kbp以?xún)?nèi)可能不是很明顯） 如果第一段CDS的stop codon 出現(xiàn)在RBS后面，那么第一個(gè)CDS的翻譯會(huì)幫助解除mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而幫助第二個(gè)cistron的翻譯(強(qiáng)度只取決于RBS的序列，和第二個(gè)CDS的起始部分無(wú)關(guān)，沒(méi)有RBS幾乎不翻譯) 如果第一段CDS的Stop codon在第二個(gè)RBS之前，那么第二個(gè)CDS的翻譯很不好預(yù)測(cè)，可以通過(guò)RBS二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行一些分析，不過(guò)準(zhǔn)確率大概就50%（具體看 http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n10/full/nbt.1568.html ） 所以此時(shí)如果想有效的去除5‘sequence 對(duì)第二個(gè)cistron的影響，可以使用我上面提到的第二 三篇文章的方法，當(dāng)然最簡(jiǎn)單的方法就是再克隆一遍啟動(dòng)子往后的序列，這樣最保險(xiǎn)。 |
6樓2013-08-28 12:49:21
|
1、我的兩個(gè)多肽加起來(lái)有600多bp，第二個(gè)cds翻譯的效率應(yīng)該不會(huì)受到很大影響吧？ 2、“如果第一段CDS的stop codon 出現(xiàn)在RBS后面，那么第一個(gè)CDS的翻譯會(huì)幫助解除mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)” 什么意思啊，是不是說(shuō)第二個(gè)基因的RBS也同時(shí)作為第一個(gè)基因的編碼序列�。� 3、“不過(guò)準(zhǔn)確率大概就50%”這個(gè)概率說(shuō)明什么， 是不能很好的識(shí)別第二個(gè)基因的起始密碼子嗎？ 4、求教關(guān)于兩個(gè)基因之間的序列設(shè)計(jì)以及第二個(gè)基因RBS與ATG之間的序列設(shè)計(jì)； 謝謝  |
7樓2013-08-28 13:54:02
Haibara_Ai
銅蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 57 (初中生)
- 金幣: 1896.7
- 帖子: 262
- 在線: 306.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2222431
★
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
|
1. 距離不重要，但rbs的interaction只和序列有關(guān)，影響未知 2. 是的比如我給你的第一篇文章出現(xiàn)類(lèi)似（aggaggt）tttaatg的序列時(shí)如果第一個(gè)蛋白質(zhì)翻譯在TAAtg的TAA終止，（括號(hào)內(nèi)是RBS），那么如果從最后的ATG起始時(shí)可以保住消除mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu) 3. 指你如果用自由能預(yù)測(cè)RBS強(qiáng)度 4. 省事得話(huà)直接另外加一個(gè)promoter，這樣是最不用操心的。 其次把你的第二個(gè)RBS 扔到https://salis.psu.edu/software/ 這里算下活性，和去掉第一段cds作為上游序列時(shí)比較下，差異不大，并且數(shù)字還可以（至少幾K吧），可以考慮 更麻煩但是理論上可以用的方法，參考上面的第二篇文章（第一篇文章需要特定RBS序列出現(xiàn)在第一個(gè)蛋白里，一般不符合你的情況。），在第一個(gè)Stop condon后面加一個(gè)RiboJ序列（最好稍微有點(diǎn)距離），這樣最后mRNA會(huì)被RiboJ分成兩段獨(dú)立的mRNA |
8樓2013-08-28 22:00:55
cicelyzh
鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
- MolEPI: 10
- 應(yīng)助: 1662 (講師)
- 金幣: 8693.8
- 帖子: 3516
- 在線: 456小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1614001
9樓2013-08-28 22:12:31
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 單單VS雙雙 的主題更新
| 9 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 省雙一流重點(diǎn)一本大學(xué)招收調(diào)劑 +3 | wwwwffffff 2026-03-31 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 一志愿武理材料工程302調(diào)劑環(huán)化或化工 +8 | Doleres 2026-03-31 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 材料工程085601數(shù)二英一335求調(diào)劑 +5 | 雙馬尾痞老板2 2026-03-31 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境工程297分求調(diào)劑一志愿杭高院 +6 | GENJIOW 2026-03-31 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料求調(diào)劑 一志愿哈工大總分298分，前三科223分 +11 | dongfang59 2026-03-27 | 11/550 |
|
|
[考研] 一志愿：西北大學(xué)，英一數(shù)一408-284分求調(diào)劑 +6 | 12.27 2026-03-27 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑求院校招收 +7 | 鶴鯨鴿 2026-03-28 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿大連理工大學(xué)，機(jī)械工程學(xué)碩，341 +3 | 西瓜田的守望者 2026-03-30 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 269求調(diào)劑 +4 | 我想讀研11 2026-03-31 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0856調(diào)劑 +6 | 曲聽(tīng)筠 2026-03-30 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿 南京航空航天大學(xué) ，080500材料科學(xué)與工程學(xué)碩 +5 | @taotao 2026-03-30 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿中海洋320化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)碩求調(diào)劑 +8 | 披星河 2026-03-30 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 一志愿北京化工大學(xué)材料與化工（085600）296求調(diào)劑 +25 | 稻妻小編 2026-03-26 | 25/1250 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境科學(xué)與工程334分求調(diào)劑 +6 | 王一一依依 2026-03-30 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 生物技術(shù)與工程 +7 | 1294608413 2026-03-25 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑考研 +3 | 王杰一 2026-03-29 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 數(shù)一英一271專(zhuān)碩（085401）求調(diào)劑，可跨 +7 | 前行必有光 2026-03-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 085602 化工專(zhuān)碩 338分 求調(diào)劑 +12 | 路癡小琪 2026-03-27 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 292求調(diào)劑 +14 | 鵝鵝鵝額額額額?/a> 2026-03-25 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 295求調(diào)劑 +5 | 1428151015 2026-03-27 | 6/300 |
|