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[交流] 雙順反子表達(dá)載體的構(gòu)建——求助！

正在構(gòu)建雙順反子表達(dá)載體，用的是pet-32a 有幾個(gè)問題請教高人指點(diǎn)
1、第一個(gè)基因需不需要ATG還是直接用成熟肽，終止密碼子需不需要去掉；
2、第二個(gè)基因之前除了要加RBS序列還需要添加別的序列嗎，ATG是否需要帶著；3、第二個(gè)基因從哪里開始編碼是否RBS會(huì)被識(shí)別成三聯(lián)密碼子翻譯成相應(yīng)氨基酸；
4、第二個(gè)基因不加RBS，第一個(gè)基因不加終止密碼子，是否會(huì)使兩條多肽串聯(lián)起來，這樣形式的蛋白經(jīng)過變性復(fù)性能否具有相應(yīng)的生物學(xué)活性（兩個(gè)多肽，是同一蛋白的兩個(gè)亞單位）

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1樓 2013-08-27 23:50:50

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6樓: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-08-28 12:49:21
2. 用不用強(qiáng)啟動(dòng)子和需不需要RBS有毛線關(guān)系。啟動(dòng)子只控制轉(zhuǎn)錄，核糖體結(jié)合位點(diǎn)是必須的，關(guān)于連續(xù)的bicistron 表達(dá)具體可以參考以下三篇文章。

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23474465

http://www.n ...

1、我的兩個(gè)多肽加起來有600多bp，第二個(gè)cds翻譯的效率應(yīng)該不會(huì)受到很大影響吧？
2、“如果第一段CDS的stop codon 出現(xiàn)在RBS后面，那么第一個(gè)CDS的翻譯會(huì)幫助解除mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)” 什么意思啊，是不是說第二個(gè)基因的RBS也同時(shí)作為第一個(gè)基因的編碼序列��？
3、“不過準(zhǔn)確率大概就50%”這個(gè)概率說明什么，是不能很好的識(shí)別第二個(gè)基因的起始密碼子嗎？
4、求教關(guān)于兩個(gè)基因之間的序列設(shè)計(jì)以及第二個(gè)基因RBS與ATG之間的序列設(shè)計(jì)；
謝謝

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7樓2013-08-28 13:54:02

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cicelyzh

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myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-28 13:53:06

1. 如果你指向表達(dá)成熟肽，可以去掉原序列里的信號(hào)肽編碼序列，但是需要有ATG作為起始密碼子。這樣表達(dá)出來的產(chǎn)物比成熟肽多一個(gè)Met。如果你不想把兩個(gè)基因融合表達(dá)，就不要去掉第一個(gè)序列的終止密碼子。
2. 第二個(gè)基因之前不用加核糖體結(jié)合位點(diǎn)。pet-32a用的是強(qiáng)啟動(dòng)子，沒有終止子序列的情況下核糖體不會(huì)脫落。第二個(gè)基因的ATG需要保留，第二個(gè)基因就是從其ATG開設(shè)表達(dá)。
3. 兩個(gè)序列之間不用保持閱讀框，除非你想做成融合蛋白。
3. 融合蛋白是否保留原來的活性的確要看是否正確折疊成獨(dú)立結(jié)構(gòu)，一般會(huì)在兩個(gè)蛋白之間加linker。

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2樓2013-08-28 02:29:54

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2樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-28 02:29:54
1. 如果你指向表達(dá)成熟肽，可以去掉原序列里的信號(hào)肽編碼序列，但是需要有ATG作為起始密碼子。這樣表達(dá)出來的產(chǎn)物比成熟肽多一個(gè)Met。如果你不想把兩個(gè)基因融合表達(dá)，就不要去掉第一個(gè)序列的終止密碼子。
2. 第二個(gè) ...

感謝老師幫助，受益匪淺，還有幾個(gè)地方不太明白
1、第一個(gè)基因的翻譯起始位點(diǎn)應(yīng)該是載體RBS下游的第一個(gè)ATG吧，也就是說在表達(dá)我目的片段的氨基酸之前還要表達(dá)載體上的氨基酸100多個(gè)，這樣的話我第一個(gè)基因添加ATG的作用是什么呢，第一個(gè)基因表達(dá)出來的蛋白是不是就是各種Tag 加上我的目的蛋白的融合蛋白？
2、載體兩翼都有His.tag有沒有必要都保留？
3、第一個(gè)基因如果帶著終止密碼子，第二個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯會(huì)不會(huì)受到影響？第二個(gè)基因我可以用TAA做終止密碼子，不讓下游His.tag 表達(dá)嗎？

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3樓2013-08-28 10:18:26

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-08-28 19:21:27

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3樓: Originally posted by 單單VS雙雙 at 2013-08-28 10:18:26
感謝老師幫助，受益匪淺，還有幾個(gè)地方不太明白
1、第一個(gè)基因的翻譯起始位點(diǎn)應(yīng)該是載體RBS下游的第一個(gè)ATG吧，也就是說在表達(dá)我目的片段的氨基酸之前還要表達(dá)載體上的氨基酸100多個(gè)，這樣的話我第一個(gè)基因添加AT ...

1. 你可以選擇不同的酶切位點(diǎn)克隆來實(shí)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物帶什么tag。pET-32a的確可以在N端融合多個(gè)tag，并且這些tag是可以在純化后切除的。這種情況，你實(shí)際上是先表達(dá)出帶標(biāo)簽的融合蛋白，所以第一個(gè)目的基因的ATG可以不要，但要注意序列的閱讀框與前面的融合標(biāo)簽相符，避免移碼。
2. his-tag留一個(gè)就可以了。載體這樣設(shè)計(jì)是為了克隆方便。有些蛋白的N端或者C端對活性很重要，只有一邊的標(biāo)簽純化出來的蛋白有活性。
3. 第一個(gè)基因的終止密碼子不會(huì)影響第二個(gè)基因的表達(dá)，有終止密碼子可以避免形成融合蛋白。當(dāng)然如果你想做融合表達(dá)的話，應(yīng)該去掉第一個(gè)基因的終止密碼子。第二個(gè)基因的TAA如果保留，表達(dá)出來的蛋白的C端是沒有his-tag。

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4樓2013-08-28 11:40:12

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