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雙順?lè)醋?表達(dá)載體的構(gòu)建——求助！
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正在構(gòu)建雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體，用的是pet-32a 有幾個(gè)問(wèn)題請(qǐng)教高人指點(diǎn) 1、第一個(gè)基因需不需要ATG還是直接用成熟肽，終止密碼子需不需要去掉； 2、第二個(gè)基因之前除了要加RBS序列還需要添加別的序列嗎，ATG是否需要帶著；3、第二個(gè)基因從哪里開(kāi)始編碼是否RBS會(huì)被識(shí)別成三聯(lián)密碼子翻譯成相應(yīng)氨基酸； 4、第二個(gè)基因不加RBS，第一個(gè)基因不加終止密碼子，是否會(huì)使兩條多肽串聯(lián)起來(lái)，這樣形式的蛋白經(jīng)過(guò)變性復(fù)性能否具有相應(yīng)的生物學(xué)活性（兩個(gè)多肽，是同一蛋白的兩個(gè)亞單位） |
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cicelyzh
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1. 如果你指向表達(dá)成熟肽，可以去掉原序列里的信號(hào)肽編碼序列，但是需要有ATG作為起始密碼子。這樣表達(dá)出來(lái)的產(chǎn)物比成熟肽多一個(gè)Met。如果你不想把兩個(gè)基因融合表達(dá)，就不要去掉第一個(gè)序列的終止密碼子。 2. 第二個(gè)基因之前不用加核糖體結(jié)合位點(diǎn)。pet-32a用的是強(qiáng)啟動(dòng)子，沒(méi)有終止子序列的情況下核糖體不會(huì)脫落。第二個(gè)基因的ATG需要保留，第二個(gè)基因就是從其ATG開(kāi)設(shè)表達(dá)。 3. 兩個(gè)序列之間不用保持閱讀框，除非你想做成融合蛋白。 3. 融合蛋白是否保留原來(lái)的活性的確要看是否正確折疊成獨(dú)立結(jié)構(gòu)，一般會(huì)在兩個(gè)蛋白之間加linker。 |
2樓2013-08-28 02:29:54
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感謝老師幫助，受益匪淺，還有幾個(gè)地方不太明白 1、第一個(gè)基因的翻譯起始位點(diǎn)應(yīng)該是載體RBS下游的第一個(gè)ATG吧，也就是說(shuō)在表達(dá)我目的片段的氨基酸之前還要表達(dá)載體上的氨基酸100多個(gè)，這樣的話我第一個(gè)基因添加ATG的作用是什么呢，第一個(gè)基因表達(dá)出來(lái)的蛋白是不是就是各種Tag 加上我的目的蛋白的融合蛋白？ 2、載體兩翼都有His.tag有沒(méi)有必要都保留？ 3、第一個(gè)基因如果帶著終止密碼子，第二個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯會(huì)不會(huì)受到影響？第二個(gè)基因我可以用TAA做終止密碼子，不讓下游His.tag 表達(dá)嗎？ |
3樓2013-08-28 10:18:26
cicelyzh
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-08-28 19:21:27
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1. 你可以選擇不同的酶切位點(diǎn)克隆來(lái)實(shí)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物帶什么tag。pET-32a的確可以在N端融合多個(gè)tag，并且這些tag是可以在純化后切除的。這種情況，你實(shí)際上是先表達(dá)出帶標(biāo)簽的融合蛋白，所以第一個(gè)目的基因的ATG可以不要，但要注意序列的閱讀框與前面的融合標(biāo)簽相符，避免移碼。 2. his-tag留一個(gè)就可以了。載體這樣設(shè)計(jì)是為了克隆方便。有些蛋白的N端或者C端對(duì)活性很重要，只有一邊的標(biāo)簽純化出來(lái)的蛋白有活性。 3. 第一個(gè)基因的終止密碼子不會(huì)影響第二個(gè)基因的表達(dá)，有終止密碼子可以避免形成融合蛋白。當(dāng)然如果你想做融合表達(dá)的話，應(yīng)該去掉第一個(gè)基因的終止密碼子。第二個(gè)基因的TAA如果保留，表達(dá)出來(lái)的蛋白的C端是沒(méi)有his-tag。 |
4樓2013-08-28 11:40:12
5樓2013-08-28 12:38:24
Haibara_Ai
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2. 用不用強(qiáng)啟動(dòng)子和需不需要RBS有毛線關(guān)系。 啟動(dòng)子只控制轉(zhuǎn)錄，核糖體結(jié)合位點(diǎn)是必須的，關(guān)于連續(xù)的bicistron 表達(dá)具體可以參考以下三篇文章。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23474465 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23034349 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22983090 結(jié)論就是，如果使用E coli本身啟動(dòng)子，那么第二個(gè)CDS翻譯強(qiáng)度首先會(huì)隨著距起始位點(diǎn)變遠(yuǎn)而下降（當(dāng)然在使用T7 RNAP時(shí)候，在2-3Kbp以內(nèi)可能不是很明顯） 如果第一段CDS的stop codon 出現(xiàn)在RBS后面，那么第一個(gè)CDS的翻譯會(huì)幫助解除mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而幫助第二個(gè)cistron的翻譯(強(qiáng)度只取決于RBS的序列，和第二個(gè)CDS的起始部分無(wú)關(guān)，沒(méi)有RBS幾乎不翻譯) 如果第一段CDS的Stop codon在第二個(gè)RBS之前，那么第二個(gè)CDS的翻譯很不好預(yù)測(cè)，可以通過(guò)RBS二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行一些分析，不過(guò)準(zhǔn)確率大概就50%（具體看 http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n10/full/nbt.1568.html ） 所以此時(shí)如果想有效的去除5‘sequence 對(duì)第二個(gè)cistron的影響，可以使用我上面提到的第二 三篇文章的方法，當(dāng)然最簡(jiǎn)單的方法就是再克隆一遍啟動(dòng)子往后的序列，這樣最保險(xiǎn)。 |
6樓2013-08-28 12:49:21
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1、我的兩個(gè)多肽加起來(lái)有600多bp，第二個(gè)cds翻譯的效率應(yīng)該不會(huì)受到很大影響吧？ 2、“如果第一段CDS的stop codon 出現(xiàn)在RBS后面，那么第一個(gè)CDS的翻譯會(huì)幫助解除mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)” 什么意思啊，是不是說(shuō)第二個(gè)基因的RBS也同時(shí)作為第一個(gè)基因的編碼序列�。� 3、“不過(guò)準(zhǔn)確率大概就50%”這個(gè)概率說(shuō)明什么， 是不能很好的識(shí)別第二個(gè)基因的起始密碼子嗎？ 4、求教關(guān)于兩個(gè)基因之間的序列設(shè)計(jì)以及第二個(gè)基因RBS與ATG之間的序列設(shè)計(jì)； 謝謝  |
7樓2013-08-28 13:54:02
Haibara_Ai
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1. 距離不重要，但rbs的interaction只和序列有關(guān)，影響未知 2. 是的比如我給你的第一篇文章出現(xiàn)類似（aggaggt）tttaatg的序列時(shí)如果第一個(gè)蛋白質(zhì)翻譯在TAAtg的TAA終止，（括號(hào)內(nèi)是RBS），那么如果從最后的ATG起始時(shí)可以保住消除mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu) 3. 指你如果用自由能預(yù)測(cè)RBS強(qiáng)度 4. 省事得話直接另外加一個(gè)promoter，這樣是最不用操心的。 其次把你的第二個(gè)RBS 扔到https://salis.psu.edu/software/ 這里算下活性，和去掉第一段cds作為上游序列時(shí)比較下，差異不大，并且數(shù)字還可以（至少幾K吧），可以考慮 更麻煩但是理論上可以用的方法，參考上面的第二篇文章（第一篇文章需要特定RBS序列出現(xiàn)在第一個(gè)蛋白里，一般不符合你的情況。），在第一個(gè)Stop condon后面加一個(gè)RiboJ序列（最好稍微有點(diǎn)距離），這樣最后mRNA會(huì)被RiboJ分成兩段獨(dú)立的mRNA |
8樓2013-08-28 22:00:55
cicelyzh
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