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單單VS雙雙

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[交流] 雙順?lè)醋?表達(dá)載體的構(gòu)建——求助！

正在構(gòu)建雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體，用的是pet-32a 有幾個(gè)問(wèn)題請(qǐng)教高人指點(diǎn)
1、第一個(gè)基因需不需要ATG還是直接用成熟肽，終止密碼子需不需要去掉；
2、第二個(gè)基因之前除了要加RBS序列還需要添加別的序列嗎，ATG是否需要帶著；3、第二個(gè)基因從哪里開(kāi)始編碼是否RBS會(huì)被識(shí)別成三聯(lián)密碼子翻譯成相應(yīng)氨基酸；
4、第二個(gè)基因不加RBS，第一個(gè)基因不加終止密碼子，是否會(huì)使兩條多肽串聯(lián)起來(lái)，這樣形式的蛋白經(jīng)過(guò)變性復(fù)性能否具有相應(yīng)的生物學(xué)活性（兩個(gè)多肽，是同一蛋白的兩個(gè)亞單位）

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1樓 2013-08-27 23:50:50

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cicelyzh

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5樓: Originally posted by 單單VS雙雙 at 2013-08-28 12:38:24
之前我一直以為RBS序列必須得有呢！確認(rèn)一下
1、 “沒(méi)有終止子序列的情況下核糖體不會(huì)脫落”您說(shuō)的這個(gè)終止子是指terminator 不是終止密碼子是吧？
2、如果涉及到共表達(dá)的兩個(gè)蛋白的純化是不是兩邊的His.tag都得 ...

1. 我說(shuō)的終止子就是terminator，不是終止密碼子。
2. 一個(gè)his-tag做純化就足夠了。兩個(gè)有時(shí)候反而有問(wèn)題。而且多加一個(gè)tag增加了對(duì)蛋白的折疊和活性影響的未知因素。不過(guò)做克隆時(shí)為了保險(xiǎn)起見(jiàn)，往往C端和N端tag都做。

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9樓2013-08-28 22:12:31

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cicelyzh

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單單VS雙雙: 金幣+5 2013-08-28 10:19:09
myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-28 13:53:06

1. 如果你指向表達(dá)成熟肽，可以去掉原序列里的信號(hào)肽編碼序列，但是需要有ATG作為起始密碼子。這樣表達(dá)出來(lái)的產(chǎn)物比成熟肽多一個(gè)Met。如果你不想把兩個(gè)基因融合表達(dá)，就不要去掉第一個(gè)序列的終止密碼子。
2. 第二個(gè)基因之前不用加核糖體結(jié)合位點(diǎn)。pet-32a用的是強(qiáng)啟動(dòng)子，沒(méi)有終止子序列的情況下核糖體不會(huì)脫落。第二個(gè)基因的ATG需要保留，第二個(gè)基因就是從其ATG開(kāi)設(shè)表達(dá)。
3. 兩個(gè)序列之間不用保持閱讀框，除非你想做成融合蛋白。
3. 融合蛋白是否保留原來(lái)的活性的確要看是否正確折疊成獨(dú)立結(jié)構(gòu)，一般會(huì)在兩個(gè)蛋白之間加linker。

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2樓2013-08-28 02:29:54

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單單VS雙雙

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2樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-28 02:29:54
1. 如果你指向表達(dá)成熟肽，可以去掉原序列里的信號(hào)肽編碼序列，但是需要有ATG作為起始密碼子。這樣表達(dá)出來(lái)的產(chǎn)物比成熟肽多一個(gè)Met。如果你不想把兩個(gè)基因融合表達(dá)，就不要去掉第一個(gè)序列的終止密碼子。
2. 第二個(gè) ...

感謝老師幫助，受益匪淺，還有幾個(gè)地方不太明白
1、第一個(gè)基因的翻譯起始位點(diǎn)應(yīng)該是載體RBS下游的第一個(gè)ATG吧，也就是說(shuō)在表達(dá)我目的片段的氨基酸之前還要表達(dá)載體上的氨基酸100多個(gè)，這樣的話我第一個(gè)基因添加ATG的作用是什么呢，第一個(gè)基因表達(dá)出來(lái)的蛋白是不是就是各種Tag 加上我的目的蛋白的融合蛋白？
2、載體兩翼都有His.tag有沒(méi)有必要都保留？
3、第一個(gè)基因如果帶著終止密碼子，第二個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯會(huì)不會(huì)受到影響？第二個(gè)基因我可以用TAA做終止密碼子，不讓下游His.tag 表達(dá)嗎？

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3樓2013-08-28 10:18:26

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-08-28 19:21:27

引用回帖:

3樓: Originally posted by 單單VS雙雙 at 2013-08-28 10:18:26
感謝老師幫助，受益匪淺，還有幾個(gè)地方不太明白
1、第一個(gè)基因的翻譯起始位點(diǎn)應(yīng)該是載體RBS下游的第一個(gè)ATG吧，也就是說(shuō)在表達(dá)我目的片段的氨基酸之前還要表達(dá)載體上的氨基酸100多個(gè)，這樣的話我第一個(gè)基因添加AT ...

1. 你可以選擇不同的酶切位點(diǎn)克隆來(lái)實(shí)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物帶什么tag。pET-32a的確可以在N端融合多個(gè)tag，并且這些tag是可以在純化后切除的。這種情況，你實(shí)際上是先表達(dá)出帶標(biāo)簽的融合蛋白，所以第一個(gè)目的基因的ATG可以不要，但要注意序列的閱讀框與前面的融合標(biāo)簽相符，避免移碼。
2. his-tag留一個(gè)就可以了。載體這樣設(shè)計(jì)是為了克隆方便。有些蛋白的N端或者C端對(duì)活性很重要，只有一邊的標(biāo)簽純化出來(lái)的蛋白有活性。
3. 第一個(gè)基因的終止密碼子不會(huì)影響第二個(gè)基因的表達(dá)，有終止密碼子可以避免形成融合蛋白。當(dāng)然如果你想做融合表達(dá)的話，應(yīng)該去掉第一個(gè)基因的終止密碼子。第二個(gè)基因的TAA如果保留，表達(dá)出來(lái)的蛋白的C端是沒(méi)有his-tag。

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4樓2013-08-28 11:40:12

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