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[交流]
雙順反子 表達載體的構(gòu)建——求助！
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正在構(gòu)建雙順反子表達載體，用的是pet-32a 有幾個問題請教高人指點 1、第一個基因需不需要ATG還是直接用成熟肽，終止密碼子需不需要去掉； 2、第二個基因之前除了要加RBS序列還需要添加別的序列嗎，ATG是否需要帶著；3、第二個基因從哪里開始編碼是否RBS會被識別成三聯(lián)密碼子翻譯成相應(yīng)氨基酸； 4、第二個基因不加RBS，第一個基因不加終止密碼子，是否會使兩條多肽串聯(lián)起來，這樣形式的蛋白經(jīng)過變性復(fù)性能否具有相應(yīng)的生物學(xué)活性（兩個多肽，是同一蛋白的兩個亞單位） |
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單單VS雙雙: 金幣+5 2013-08-28 10:19:09
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-28 13:53:06
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1. 如果你指向表達成熟肽，可以去掉原序列里的信號肽編碼序列，但是需要有ATG作為起始密碼子。這樣表達出來的產(chǎn)物比成熟肽多一個Met。如果你不想把兩個基因融合表達，就不要去掉第一個序列的終止密碼子。 2. 第二個基因之前不用加核糖體結(jié)合位點。pet-32a用的是強啟動子，沒有終止子序列的情況下核糖體不會脫落。第二個基因的ATG需要保留，第二個基因就是從其ATG開設(shè)表達。 3. 兩個序列之間不用保持閱讀框，除非你想做成融合蛋白。 3. 融合蛋白是否保留原來的活性的確要看是否正確折疊成獨立結(jié)構(gòu)，一般會在兩個蛋白之間加linker。 |
2樓2013-08-28 02:29:54
3樓2013-08-28 10:18:26
★ ★ ★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2013-08-28 19:21:27
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1. 你可以選擇不同的酶切位點克隆來實現(xiàn)表達產(chǎn)物帶什么tag。pET-32a的確可以在N端融合多個tag，并且這些tag是可以在純化后切除的。這種情況，你實際上是先表達出帶標(biāo)簽的融合蛋白，所以第一個目的基因的ATG可以不要，但要注意序列的閱讀框與前面的融合標(biāo)簽相符，避免移碼。 2. his-tag留一個就可以了。載體這樣設(shè)計是為了克隆方便。有些蛋白的N端或者C端對活性很重要，只有一邊的標(biāo)簽純化出來的蛋白有活性。 3. 第一個基因的終止密碼子不會影響第二個基因的表達，有終止密碼子可以避免形成融合蛋白。當(dāng)然如果你想做融合表達的話，應(yīng)該去掉第一個基因的終止密碼子。第二個基因的TAA如果保留，表達出來的蛋白的C端是沒有his-tag。 |
4樓2013-08-28 11:40:12
5樓2013-08-28 12:38:24
★ ★
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2. 用不用強啟動子和需不需要RBS有毛線關(guān)系。 啟動子只控制轉(zhuǎn)錄，核糖體結(jié)合位點是必須的，關(guān)于連續(xù)的bicistron 表達具體可以參考以下三篇文章。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23474465 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23034349 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22983090 結(jié)論就是，如果使用E coli本身啟動子，那么第二個CDS翻譯強度首先會隨著距起始位點變遠而下降（當(dāng)然在使用T7 RNAP時候，在2-3Kbp以內(nèi)可能不是很明顯） 如果第一段CDS的stop codon 出現(xiàn)在RBS后面，那么第一個CDS的翻譯會幫助解除mRNA的二級結(jié)構(gòu)，從而幫助第二個cistron的翻譯(強度只取決于RBS的序列，和第二個CDS的起始部分無關(guān)，沒有RBS幾乎不翻譯) 如果第一段CDS的Stop codon在第二個RBS之前，那么第二個CDS的翻譯很不好預(yù)測，可以通過RBS二級結(jié)構(gòu)進行一些分析，不過準(zhǔn)確率大概就50%（具體看 http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n10/full/nbt.1568.html ） 所以此時如果想有效的去除5‘sequence 對第二個cistron的影響，可以使用我上面提到的第二 三篇文章的方法，當(dāng)然最簡單的方法就是再克隆一遍啟動子往后的序列，這樣最保險。 |
6樓2013-08-28 12:49:21
7樓2013-08-28 13:54:02
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1. 距離不重要，但rbs的interaction只和序列有關(guān)，影響未知 2. 是的比如我給你的第一篇文章出現(xiàn)類似（aggaggt）tttaatg的序列時如果第一個蛋白質(zhì)翻譯在TAAtg的TAA終止，（括號內(nèi)是RBS），那么如果從最后的ATG起始時可以保住消除mRNA二級結(jié)構(gòu) 3. 指你如果用自由能預(yù)測RBS強度 4. 省事得話直接另外加一個promoter，這樣是最不用操心的。 其次把你的第二個RBS 扔到https://salis.psu.edu/software/ 這里算下活性，和去掉第一段cds作為上游序列時比較下，差異不大，并且數(shù)字還可以（至少幾K吧），可以考慮 更麻煩但是理論上可以用的方法，參考上面的第二篇文章（第一篇文章需要特定RBS序列出現(xiàn)在第一個蛋白里，一般不符合你的情況。），在第一個Stop condon后面加一個RiboJ序列（最好稍微有點距離），這樣最后mRNA會被RiboJ分成兩段獨立的mRNA |
8樓2013-08-28 22:00:55
9樓2013-08-28 22:12:31
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