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亞瑟王1987新蟲 (初入文壇)
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亞瑟王1987
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2樓2013-09-06 09:56:04
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5樓2013-09-07 11:45:07
凌波麗
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樓主的WB轉(zhuǎn)膜應(yīng)該是完全沒有轉(zhuǎn)上目的蛋白質(zhì)到NC膜上，可以有如下解決方法（濕轉(zhuǎn)法）： 1.轉(zhuǎn)移緩沖溶液中加入終濃度為20%的甲醇溶液，甲醇可以降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但是增加蛋白質(zhì)與NC膜的結(jié)合能力；甲醇可以防止凝膠變形；甲醇對(duì)于高分子蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間。 2.轉(zhuǎn)移緩沖溶液中加入終濃度為0.1%的SDS。轉(zhuǎn)膜實(shí)際上就是讓蛋白質(zhì)進(jìn)入硝纖膜的纖維分子之間的空隙，所以蛋白質(zhì)變成線狀比較容易滲入到硝纖膜的纖維分子之間，因?yàn)榭臻g位阻小，且不容易在掉下來，所以在轉(zhuǎn)膜緩沖液中加入矢量濃度的SDS（可配置為：終濃度為0.1%這個(gè)濃度不可讓蛋白質(zhì)完全變?yōu)榫�狀，不然會(huì)影響后面的免疫識(shí)別）使得蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象變?yōu)榫�形比較容易操作成功。熱變性的蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象不是完全線形的，其中還存在很多的二級(jí)結(jié)構(gòu)，盡管并非天然二級(jí)結(jié)構(gòu)，但是仍然對(duì)于蛋白質(zhì)進(jìn)入硝纖膜的纖維分子之間的空隙會(huì)構(gòu)成位阻效應(yīng)，在大分子量的蛋白質(zhì)中的熱變性的非天然二級(jí)結(jié)構(gòu)更多，所以位阻效應(yīng)在轉(zhuǎn)膜時(shí)更加明顯。至于免疫反應(yīng)那一步，抗體識(shí)別抗原的免疫決定簇有空間免疫決定簇也有序列免疫決定簇，一般只要不是蛋白質(zhì)完全變?yōu)榫�形且無序列免疫決定簇，就不會(huì)沒有免疫識(shí)別的現(xiàn)象出現(xiàn)。 3.使用小孔徑的NC膜，孔徑0.2um的膜。 4.使用戊二醛交聯(lián)蛋白質(zhì)。上樣后可以用戊二醛交聯(lián)膜上的蛋白質(zhì)，這樣蛋白質(zhì)自身構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)與NC膜的纖維網(wǎng)絡(luò)會(huì)彼此交叉構(gòu)成約束，使得NC膜上的蛋白質(zhì)不易被洗下來。 5.對(duì)于大分子量的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜時(shí)電壓要高一點(diǎn)，一般 恒壓100V，限流400mA，時(shí)間也要延長(zhǎng)一點(diǎn)，比3小時(shí)要長(zhǎng)，開始最好也用兩塊膜，注意加強(qiáng)降溫措施，在槽的一邊放一塊冰來降溫。 6.適當(dāng)增加轉(zhuǎn)膜時(shí)間。 對(duì)于大分子量的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜時(shí)電壓要高一點(diǎn)，一般 恒壓100V，限流400mA，時(shí)間也要延長(zhǎng)一點(diǎn)，比3小時(shí)要長(zhǎng)，注意加強(qiáng)降溫措施，在槽的一邊放一塊冰來降溫。 |
6樓2013-09-07 15:02:20
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