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lingling1988銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
小目的片段的測(cè)序及設(shè)計(jì)引物的疑問
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| 我要對(duì)回收到的一些目的片段進(jìn)行測(cè)序，目前出現(xiàn)的問題：一，這些目的片段中有的本來應(yīng)該在800-1000bp之間不等，可是再用相應(yīng)的引物并以它們?yōu)槟０遄鯬CR，在瓊脂糖凝膠上檢測(cè)的結(jié)果卻只有250-500bp之間；其二，就是有些片段本身很小，100-500bp，PCR檢測(cè)的結(jié)果也與其對(duì)應(yīng)，但是我的疑問是對(duì)于這么小的目的片段，想拿去測(cè)序的話，在連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒檢測(cè)等方面應(yīng)該注意哪些細(xì)節(jié)，以及在設(shè)計(jì)引物時(shí)要注意什么問題？ |
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lingling1988
銅蟲 (初入文壇)
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3樓2013-09-13 22:52:15
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
lingling1988(wizardfan代發(fā)): 金幣+4, 謝謝分享經(jīng)驗(yàn) 2013-09-17 06:30:33
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
lingling1988(wizardfan代發(fā)): 金幣+4, 謝謝分享經(jīng)驗(yàn) 2013-09-17 06:30:33
| 其他的應(yīng)該沒有太大問題，按一般情況做就好，就是小片段跑膠的時(shí)候需要濃度高點(diǎn)的膠，不然和你引物二聚體分不開。我要說的是連接問題，個(gè)人覺得300bp以上的連接都沒問題，但100bp的話有點(diǎn)小，連接的時(shí)候可以適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，如果T-A連接可能還好，但如果是酶切后連接可以在連接前將載體和PCR產(chǎn)物在65°加熱5 min，然后再連接！Good luck！ |
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2樓2013-09-13 22:20:37
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