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我要吃西瓜金蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR特異性問題求助
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如題，最近在做分子克隆，根據(jù)一段序列設(shè)計了引物，使用反轉(zhuǎn)錄出來的cDNA作為模板，但是結(jié)果一直很不理想 做了一下溫度梯度進行PCR，結(jié)果還是這樣，求幫忙分析 一共是3對引物 marker使用的是DS2000 左右兩邊各位marker，中間每三個為一個溫度，每個溫度從左到右產(chǎn)物長度分別是400+，600+，200+ [ Last edited by 我要吃西瓜 on 2013-9-28 at 12:45 ] |
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我要吃西瓜
金蟲 (初入文壇)
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3樓2013-09-28 16:22:55
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【答案】應助回帖
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1.引物設(shè)計好要在NCBI的blast上檢索特異性，看看能不能引起非特異擴增。如果非特異的片段和目的片段差異小而且同引物的匹配度高，則修改引物。（特異性不好，單靠調(diào)整PCR條件是不行的）。 2.600bp降低引物濃度，減少延伸時間電泳時間延長。400bp的退火溫度降一點試試。200bp的溫度左一，左二左右。然后膠回收目的帶，稀釋100到1000倍做模板，做二次PCR試試（突變率會高一些，循環(huán)數(shù)25左右）。 |
5樓2013-09-29 09:04:53
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