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我要吃西瓜金蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR特異性問題求助
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如題，最近在做分子克隆，根據(jù)一段序列設(shè)計(jì)了引物，使用反轉(zhuǎn)錄出來的cDNA作為模板，但是結(jié)果一直很不理想 做了一下溫度梯度進(jìn)行PCR，結(jié)果還是這樣，求幫忙分析 一共是3對引物 marker使用的是DS2000 左右兩邊各位marker，中間每三個為一個溫度，每個溫度從左到右產(chǎn)物長度分別是400+，600+，200+ [ Last edited by 我要吃西瓜 on 2013-9-28 at 12:45 ] |
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kx444555: 金幣+4, 鼓勵交流 2013-09-29 10:14:13
我要吃西瓜: 金幣+5, ★★★很有幫助, 謝謝 2013-09-29 19:55:53
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1.引物設(shè)計(jì)好要在NCBI的blast上檢索特異性，看看能不能引起非特異擴(kuò)增。如果非特異的片段和目的片段差異小而且同引物的匹配度高，則修改引物。（特異性不好，單靠調(diào)整PCR條件是不行的）。 2.600bp降低引物濃度，減少延伸時間電泳時間延長。400bp的退火溫度降一點(diǎn)試試。200bp的溫度左一，左二左右。然后膠回收目的帶，稀釋100到1000倍做模板，做二次PCR試試（突變率會高一些，循環(huán)數(shù)25左右）。 |
5樓2013-09-29 09:04:53
2樓2013-09-28 13:25:54
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我認(rèn)為擴(kuò)增成這樣已經(jīng)挺好了，你的目的是什么？？ 肯定是得到目的片段啊，現(xiàn)在應(yīng)該做的不是優(yōu)化擴(kuò)增體系，而是在現(xiàn)有的最好體系中回收目的片段。 有些時候做實(shí)驗(yàn)就是這樣，有些本末倒置，回收好相應(yīng)片段后回收純化，濃度夠的克隆或直接測序，不夠的二擴(kuò)一次接著克隆測序，效率很關(guān)鍵的，有結(jié)果才是最終目的，剩下的只是浮云。 |
9樓2013-09-30 17:05:49
10樓2013-09-30 17:12:28
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