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fuyuandj86版主 (著名寫手)
己所不欲，勿施于人
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[求助]
SDS-PAGE泳道形狀詭異
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跑SDS-PAGE把細胞裂解液上樣結果跑出來這么奇怪的形狀(最右邊兩個泳道) 我可以保證不是膠制備的問題, 換了好幾塊膠了 上樣的時候其他的泳道都沒問題,就是只要把這個細胞裂解液加上去,對應的泳道就肯定就跑成這鬼樣子 電解緩沖液也沒問題, 實驗室其他人拿我配的緩沖液跑都沒事 大概就是這裂解液樣品的問題....請問這是不是鹽濃度太高了?還是鹽濃度太低了?我這里面還有少量NP-40,不應該影響吧？大概還會殘留一些養(yǎng)細胞用的MEM... 見了鬼了，按理說我這緩沖液最多只是PBS  yf_6_131_linker_pulldown_cbb.jpg |
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7樓2013-10-06 23:05:39
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樓主的樣品電泳時不僅帶非常寬甚至可以說是彌散，所以不可能是段春上樣過多的問題，樣品處理的也不好。電壓也可考慮調整。 1.樣品處理（充分溶解樣品）：根據(jù)樣品分離目的不同，在上樣前對樣品進行的溶解處理主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。 （1）還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT(或Beta巰基乙醇)后，蛋白質構象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。 （2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶;另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。100μl樣品緩沖液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。 （3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。 2.保持各種蛋白質樣品和Marker在上樣前能夠充分溶解，上樣前最好離心一下，實在溶解不掉的顆粒就去掉。 3.減少上樣量，樓主的樣品應該稀釋十倍后再上樣。 4.可以考慮加高電泳時，濃縮膠的電壓為90-100 V，分離膠的電壓到120V-200V，；濃縮膠和分離膠有時候可能都設成150 V也能電泳成功。 5.上樣前要煮沸樣品蛋白質。 |
8樓2013-10-07 15:01:11
凌波麗
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更準確的回答： 樓主的電泳問題是SDS電泳帶彌散、拖尾，原因和解決方法如下（我今天下午剛寫好的材料）： SDS電泳帶彌散和拖尾的原因和改進措施(2013-10-7) 1.原因一：上樣量過多，應該減少上樣量。對策：加樣體積根據(jù)樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為10-15µL（即2-10µg蛋白質）。如果樣品很稀上樣量可以達到100µL。 2.原因二：樣品溶解不完全。 對策： （1）樣品應該充分溶解：保持各種蛋白質樣品和Marker在上樣前能夠充分溶解，上樣前最好離心一下，實在溶解不掉的顆粒就去掉。 (2)可以根據(jù)分子量標準的蛋白質試劑盒的要求加入樣品溶解液；如果是自行配置標準和未知樣品，按照0.5-1.0mg/L樣品溶解液。溶解后，將其轉移至Eppendorf管，蓋上蓋子（可以在蓋子處加上卡子）后在110度沸水中水浴加熱3分鐘（可以在薄泡沫塑料板上鉆出幾個與Eppendorf管直徑形同的圓洞，Eppendorf管放下去直到蓋子邊緣約束不能再往下為止，把薄泡沫塑料板的暴露出Eppendorf管的管體大部分的那一面放入沸水浴鍋中，薄泡沫塑料板自然飄在沸水表面，便于取用和加熱，也可避免沸水濺起�？梢砸慌鷮τ诙鄠�Eppendorf管進行不同時間的沸水浴。不要把Eppendorf管扔進沸水浴鍋中，蓋子可能會被沖開），而后在室溫下冷卻待用。如果較長時間不用，則將樣品放入零下20度冰箱中儲存，需用時在取出后使用前在110度沸水中加熱3分鐘室溫冷卻后再上樣，以去掉樣品蛋白質中的亞穩(wěn)態(tài)聚合體。 （3）改變樣品緩沖溶液使得樣品能夠充分溶解，SDS 用量要充分。 |
9樓2013-10-07 16:26:50
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