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fuyuandj86版主 (著名寫手)
己所不欲，勿施于人
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[求助]
SDS-PAGE泳道形狀詭異
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跑SDS-PAGE把細(xì)胞裂解液上樣結(jié)果跑出來這么奇怪的形狀(最右邊兩個(gè)泳道) 我可以保證不是膠制備的問題, 換了好幾塊膠了 上樣的時(shí)候其他的泳道都沒問題,就是只要把這個(gè)細(xì)胞裂解液加上去,對(duì)應(yīng)的泳道就肯定就跑成這鬼樣子 電解緩沖液也沒問題, 實(shí)驗(yàn)室其他人拿我配的緩沖液跑都沒事 大概就是這裂解液樣品的問題....請(qǐng)問這是不是鹽濃度太高了?還是鹽濃度太低了?我這里面還有少量NP-40,不應(yīng)該影響吧？大概還會(huì)殘留一些養(yǎng)細(xì)胞用的MEM... 見了鬼了，按理說我這緩沖液最多只是PBS  yf_6_131_linker_pulldown_cbb.jpg |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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凌波麗
專家顧問 (知名作家)
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樓主的樣品電泳時(shí)不僅帶非常寬甚至可以說是彌散，所以不可能是段春上樣過多的問題，樣品處理的也不好。電壓也可考慮調(diào)整。 1.樣品處理（充分溶解樣品）：根據(jù)樣品分離目的不同，在上樣前對(duì)樣品進(jìn)行的溶解處理主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。 （1）還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT(或Beta巰基乙醇)后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。 （2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶;另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時(shí)的紋理現(xiàn)象。100μl樣品緩沖液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。 （3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。 2.保持各種蛋白質(zhì)樣品和Marker在上樣前能夠充分溶解，上樣前最好離心一下，實(shí)在溶解不掉的顆粒就去掉。 3.減少上樣量，樓主的樣品應(yīng)該稀釋十倍后再上樣。 4.可以考慮加高電泳時(shí)，濃縮膠的電壓為90-100 V，分離膠的電壓到120V-200V，；濃縮膠和分離膠有時(shí)候可能都設(shè)成150 V也能電泳成功。 5.上樣前要煮沸樣品蛋白質(zhì)。 |
8樓2013-10-07 15:01:11
同東中郎將
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2樓2013-10-05 08:57:35
feipiaolw
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3樓2013-10-05 09:24:45
yonghuixie
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4樓2013-10-05 14:28:51
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