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云中風(fēng)華銀蟲 (小有名氣)
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原核表達(dá)只能在沉淀中檢測出目標(biāo)蛋白怎么辦
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| 本人老板現(xiàn)在讓我?guī)熜肿鲈吮磉_(dá) 目標(biāo)蛋白68kD(531aa) 用的PET-28a表達(dá)載體 做了好久一直只能在37℃用0.4M IPTG條件下誘導(dǎo)出來 并且只能在沉淀中檢測出來 但最近37℃沉淀中也檢測不到目標(biāo)蛋白 請各位大神幫忙分析一下可能的原因 順便介紹下怎樣才能讓它表達(dá)出可溶性的蛋白比如優(yōu)化條件 |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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sunpeng9907
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John_Chen
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joan198108
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6樓2013-10-07 11:05:24
云中風(fēng)華
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7樓2013-10-07 21:25:25
sunpeng9907
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8樓2013-10-07 22:24:47
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- 管轄: 生物科學(xué)綜合
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原核細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)表達(dá)量過大或者折疊異常引起產(chǎn)物形成沉淀，如果再明顯一些就形成了砂粒狀的包涵體。 防止包涵體形成的方法，樓主都可以用上。 防止包涵體出現(xiàn)常用的方法： 1.降低重組菌的生長溫度是防止包涵體出現(xiàn)最常用的方法。低生長溫度降低了無活性的聚集體的形成的速率和疏水相互作用；細(xì)菌生長緩慢溶氧水平降低，也可以減少包涵體的形成。2.在培養(yǎng)重組菌時(shí)提供豐富的培養(yǎng)，創(chuàng)造最好的培養(yǎng)條件，如：供氧充足、合適的pH值等，以減少包涵體的形成。3.添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)生長添加劑，增加細(xì)胞的滲透壓。4.在低濃度的誘導(dǎo)劑條件下培養(yǎng)重組菌，減少重組蛋白質(zhì)的表達(dá)量，也可減少包涵體的形成。5.利用硫氧還原蛋白融合表達(dá)或與目標(biāo)蛋白質(zhì)共表達(dá)，得到可溶性的蛋白質(zhì)。6.篩選合適的宿主菌，使表達(dá)的重組蛋白質(zhì)可溶。7.與目標(biāo)蛋白質(zhì)共表達(dá)某些能夠在目標(biāo)蛋白質(zhì)折疊過程中起作用的分子伴侶，得到可溶性的蛋白質(zhì)。 不過，形成沉淀也不完全是壞事，比如分離提純可能比較容易了。 至于從沉淀中獲得活性蛋白質(zhì)的方法，只要參照包涵體復(fù)性的試驗(yàn)方法即可，也就是變性劑溶解沉淀物，然后進(jìn)行稀釋，并用超濾或者層析除去變性劑。 Purification of inclusion bodies and refolding of proteins http://ishare.iask.sina.com.cn/f/18503995.html |
9樓2013-10-08 01:08:19
10樓2014-04-15 14:32:28
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