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s24512453新蟲 (初入文壇)
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[求助]
有關(guān)T載體以及藍(lán)白篩選的3個(gè)問題
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將目的片段與T載體連接，之后轉(zhuǎn)化，藍(lán)白篩選 1.長出白斑，說明T載體之間連上了片段，此片段就應(yīng)該是目的片段了，因?yàn)橹暗碾娪敬_定目的片段為單一條帶，割膠回收后再跑電泳也是單一條帶，但是后續(xù)的測序要么是片段大小不對，要么是空載。 2平板在4度放了一段時(shí)間拿出來確定菌落是白色，第二天再看還是白色，不可能是傳說中的沒有變藍(lán)，難道空載的也會是藍(lán)色？那藍(lán)白篩選還有什么作用 3菌落pcr有正確條帶，對相應(yīng)的菌提取質(zhì)粒，送去測序后結(jié)果總是不對，這是為何？感受態(tài)轉(zhuǎn)化之后的涂布量應(yīng)該怎么控制，會不會是我涂布了過多的菌泥導(dǎo)致游離的質(zhì)粒都附著在了菌落上或者周圍，導(dǎo)致的結(jié)果就是挑取十個(gè)白斑，十個(gè)白斑pcr都正確，結(jié)果測序都不對，這種可能性應(yīng)該不大吧 |
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小鯨飛揚(yáng)
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1. 白斑說明有插入，是不是目的片段就不一定了，所以藍(lán)白斑只是初篩，需要進(jìn)一步鑒定。 2. 空載體是藍(lán)斑。 3. 菌落PCR會有假陽性的可能。對陽性克隆提質(zhì)粒做酶切鑒定后再送測序。轉(zhuǎn)化涂布的量一般考經(jīng)驗(yàn)控制，新手可以多涂幾個(gè)不同量的板子。菌落PCR一般用的是載體上的引物，如果用片段特異性引物也是一個(gè)用片段特異引物，一個(gè)用載體上的引物。所以你說的什么游離DNA影響PCR擴(kuò)增的假設(shè)基本不成立。而且你也對陽性克隆提取了質(zhì)粒，應(yīng)該先做酶切鑒定，酶切圖譜正確后再測序。 |
4樓2013-10-13 01:40:09
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