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一葦杭之xmc銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
急~~~！��！sds-page電泳，重復(fù)了n次，都是這種死樣子！ 已有1人參與
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一跑就散了，而且各泳道都擴(kuò)散到一起去了�。�！而且整個(gè)過程中都跑的不整齊，不是一條線的那種。我這次特地把maker點(diǎn)在中間了，是不是真的是我樣品問題啊，而且感覺跑的比較快。已經(jīng)重復(fù)n次了，累死不說，心都哇涼哇涼的，求各位大神幫助啊~！ 我提蛋白用的成分是7M尿素 2M硫脲 2% tritonx-100 蛋白酶抑制劑 50mM DTT 提取之后我稀釋定量，基本上都在2g/L左右的。然后直接上樣。求大神指教如何處理樣品，求~~~ DSC_0634.jpg DSC_0633.jpg [ Last edited by 一葦杭之xmc on 2013-10-22 at 16:30 ] |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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西瓜
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給你個(gè)SDS-PAGE“恥辱堂”，自己對(duì)照下看看吧 http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/sdsgoofs.html |
4樓2013-10-22 20:35:58
woai43
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2樓2013-10-22 17:14:02
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5樓2013-10-22 21:28:00
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6樓2013-10-22 21:38:32
凌波麗
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-10-24 12:25:10
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SDS電泳帶彌散和拖尾的原因和改進(jìn)措施(2013-10-7) 1.原因一：上樣量過多，應(yīng)該減少上樣量。對(duì)策：加樣體積根據(jù)樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為10-15µL（即2-10µg蛋白質(zhì)）。如果樣品很稀上樣量可以達(dá)到100µL。 2.原因二：樣品溶解不完全。 對(duì)策： （1）樣品應(yīng)該充分溶解：保持各種蛋白質(zhì)樣品和Marker在上樣前能夠充分溶解，上樣前最好離心一下，實(shí)在溶解不掉的顆粒就去掉。 (2)可以根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)試劑盒的要求加入樣品溶解液；如果是自行配置標(biāo)準(zhǔn)和未知樣品，按照0.5-1.0mg/L樣品溶解液。溶解后，將其轉(zhuǎn)移至Eppendorf管，蓋上蓋子（可以在蓋子處加上卡子）后在110度沸水中水浴加熱3分鐘（可以在薄泡沫塑料板上鉆出幾個(gè)與Eppendorf管直徑形同的圓洞，Eppendorf管放下去直到蓋子邊緣約束不能再往下為止，把薄泡沫塑料板的暴露出Eppendorf管的管體大部分的那一面放入沸水浴鍋中，薄泡沫塑料板自然飄在沸水表面，便于取用和加熱，也可避免沸水濺起�？梢砸慌鷮�(duì)于多個(gè)Eppendorf管進(jìn)行不同時(shí)間的沸水浴。不要把Eppendorf管扔進(jìn)沸水浴鍋中，蓋子可能會(huì)被沖開），而后在室溫下冷卻待用。如果較長(zhǎng)時(shí)間不用，則將樣品放入零下20度冰箱中儲(chǔ)存，需用時(shí)在取出后使用前在110度沸水中加熱3分鐘室溫冷卻后再上樣，以去掉樣品蛋白質(zhì)中的亞穩(wěn)態(tài)聚合體。 （3）改變樣品緩沖溶液使得樣品能夠充分溶解，SDS 用量要充分。 SDS電泳帶變寬的原因和改進(jìn)措施(2013-10-7) 除了以上兩條原因外，還有： 原因三：SDS電泳帶與鄰近蛋白質(zhì)電泳相連。除了上樣量過多和樣品溶解不完全外，凝膠的加樣孔泄露會(huì)使得電泳帶變寬。加樣孔泄露往往由于凝膠與玻璃板之間產(chǎn)生裂紋引起。對(duì)策：此時(shí)只能重新制備凝膠，梳子拔起時(shí)要小心等凝膠凝聚完畢，速度不宜過快，拔起的方向要垂直于凝膠表面；要避免凝膠兩側(cè)的玻璃板與凝膠之間產(chǎn)生裂紋，在凝膠制備過程中不要擠壓凝膠兩側(cè)的玻璃板。 |
8樓2013-10-23 11:23:31
凌波麗
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SDS-PAGE electrophoresis的蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴(kuò)散的原因和解決方法 2013年10月24日 蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴(kuò)散可能有多種原因。 1.加樣量過多，會(huì)引起蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴(kuò)散。為了提高分辨率，應(yīng)該避免加樣過多，小體積樣品可給出窄帶.加樣體積根據(jù)樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為10-15µL（即2-10µg蛋白質(zhì)）。如果樣品很稀上樣量可以達(dá)到100µL。 2.加樣沒有立即電泳會(huì)引起蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴(kuò)散。加熱蛋白質(zhì)樣品變性需要沸水浴3-5分鐘即可，加熱變性后的蛋白質(zhì)樣品要放置到室溫即電泳，不要久放，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的二硫鍵在高溫下可能是會(huì)斷開，但是暴露于空氣中溫度降低會(huì)重新形成二硫鍵，而且可能在過久放置過程中蛋白質(zhì)可能會(huì)再折疊，更不要扔到冰箱里保存。 3.電泳凝膠濃度選擇不適當(dāng)引起蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴(kuò)散。請(qǐng)根據(jù)廠商的說明書配制對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的適當(dāng)濃度的電泳凝膠，使得蛋白質(zhì)組分的以充分分離。 4.通常靠近前沿的電泳帶分辨率不佳。應(yīng)根據(jù)分子量與凝膠孔徑的關(guān)系，灌制適當(dāng)濃度的凝膠。 5.蛋白質(zhì)樣品被水解。注意除去蛋白質(zhì)樣品的內(nèi)源性的水解酶，不要反復(fù)凍融。 6.電泳時(shí)間過長(zhǎng)或過短。溴酚藍(lán)達(dá)到分離膠的底部即應(yīng)該關(guān)閉電泳電源。 7.低于10Kd的蛋白質(zhì)分子在SDS-PAGE electrophoresis不可能獲得好的分辨率，此時(shí)要用Tricine膠。 8.緩沖溶液、SDS都要新鮮配制。 |
9樓2013-10-24 01:24:55
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