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一葦杭之xmc銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
急~~~�。�！sds-page電泳，重復(fù)了n次，都是這種死樣子！ 已有1人參與
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一跑就散了，而且各泳道都擴散到一起去了�。。《艺麄�過程中都跑的不整齊，不是一條線的那種。我這次特地把maker點在中間了，是不是真的是我樣品問題啊，而且感覺跑的比較快。已經(jīng)重復(fù)n次了，累死不說，心都哇涼哇涼的，求各位大神幫助啊~！ 我提蛋白用的成分是7M尿素 2M硫脲 2% tritonx-100 蛋白酶抑制劑 50mM DTT 提取之后我稀釋定量，基本上都在2g/L左右的。然后直接上樣。求大神指教如何處理樣品，求~~~ DSC_0634.jpg DSC_0633.jpg [ Last edited by 一葦杭之xmc on 2013-10-22 at 16:30 ] |
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 分子生化實驗經(jīng)驗積累 | 蛋白質(zhì)生物學(xué)實驗經(jīng)驗 |
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凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵交流！ 2013-10-24 12:25:01
gyesang: 金幣+2, 鼓勵交流！ 2013-10-24 12:25:01
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SDS-PAGE electrophoresis的蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴散的原因和解決方法 2013年10月24日 蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴散可能有多種原因。 1.加樣量過多，會引起蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴散。為了提高分辨率，應(yīng)該避免加樣過多，小體積樣品可給出窄帶.加樣體積根據(jù)樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為10-15µL（即2-10µg蛋白質(zhì)）。如果樣品很稀上樣量可以達(dá)到100µL。 2.加樣沒有立即電泳會引起蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴散。加熱蛋白質(zhì)樣品變性需要沸水浴3-5分鐘即可，加熱變性后的蛋白質(zhì)樣品要放置到室溫即電泳，不要久放，因為蛋白質(zhì)的二硫鍵在高溫下可能是會斷開，但是暴露于空氣中溫度降低會重新形成二硫鍵，而且可能在過久放置過程中蛋白質(zhì)可能會再折疊，更不要扔到冰箱里保存。 3.電泳凝膠濃度選擇不適當(dāng)引起蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴散。請根據(jù)廠商的說明書配制對應(yīng)蛋白質(zhì)相對分子量的適當(dāng)濃度的電泳凝膠，使得蛋白質(zhì)組分的以充分分離。 4.通�？拷把氐碾娪編Х直媛什患�。應(yīng)根據(jù)分子量與凝膠孔徑的關(guān)系，灌制適當(dāng)濃度的凝膠。 5.蛋白質(zhì)樣品被水解。注意除去蛋白質(zhì)樣品的內(nèi)源性的水解酶，不要反復(fù)凍融。 6.電泳時間過長或過短。溴酚藍(lán)達(dá)到分離膠的底部即應(yīng)該關(guān)閉電泳電源。 7.低于10Kd的蛋白質(zhì)分子在SDS-PAGE electrophoresis不可能獲得好的分辨率，此時要用Tricine膠。 8.緩沖溶液、SDS都要新鮮配制。 |
9樓2013-10-24 01:24:55
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gyesang: 回帖置頂 2013-10-24 12:24:21
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gyesang: 回帖置頂 2013-10-24 12:24:21
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給你個SDS-PAGE“恥辱堂”，自己對照下看看吧 http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/sdsgoofs.html |
4樓2013-10-22 20:35:58
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