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[求助]
SDS-PAGE中蛋白條帶位置不一致
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| 前后幾次SDS-PAGE中，同樣的樣品跑出來的蛋白條帶位置與Marker對比不一樣，第一次跑的時候，我要的目的蛋白條帶與Marker 的25 kd 的帶幾乎一樣大，但是后來跑的時候那條帶又比Marker 25 KD 的帶大了，在它上邊，哪位大俠知道這是什么原因呀？！ |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 蛋白表達(dá)純化與檢測 |
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2樓2013-10-23 10:40:00
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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如果真的形成分子間的二硫鍵或酰胺鍵或者其他的共價鍵，SDS是不可能對其加以斷裂和直接的阻止分子間的二硫鍵或酰胺鍵的形成的；因?yàn)橐赡苄纬煞肿娱g的二硫鍵或酰胺鍵的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)在變性的蛋白質(zhì)中處于分子表面，而且PH和反應(yīng)物濃度合適又處于溶液環(huán)境和暴露于空氣中，SDS是不可能阻礙兩個巰基氧化為一個二硫鍵和羧基與氨基形成酰胺鍵。SDS使得蛋白質(zhì)變性成為直的桿狀分子倒是有可能在一定程度上消除球形蛋白質(zhì)的空間位阻，當(dāng)然SDS結(jié)合上蛋白質(zhì)表面有形成新的空間位阻，但是SDS不可能每時每刻都結(jié)合在蛋白質(zhì)的表面，而且對于桿狀的蛋白質(zhì)的末端SDS是封堵不住的。再有，蛋白質(zhì)也許原來就有二硫鍵存在，SDS本身是不可能打開二硫鍵的，當(dāng)然如果上樣時加上DTT，巰基乙醇當(dāng)然能打開二硫鍵，但是SDS-PAGE不是一定要加上DTT，巰基乙醇，樓主也沒有提供此種信息。 何況即使加了DTT，巰基乙醇，酰胺鍵在一定條件下還是會形成，與SDS無關(guān)。 所以4樓的說法不對！ 其他的共價鍵情況很復(fù)雜，這里不討論。 |
8樓2013-10-24 01:19:59
3樓2013-10-23 12:16:58
20083630zhan
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2013-10-24 00:31:23
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| 不可能是蛋白質(zhì)凝聚產(chǎn)生的，因?yàn)槟阕鯯DS-PAGE時，你已經(jīng)將你的目的蛋白變性，因此不存在分子間的二硫鍵，也更無分子間構(gòu)象改變一說，如果實(shí)在你要確定你的蛋白的分子量，那么你可以做遷移率實(shí)驗(yàn)，將你的蛋白Marker 做遷移率試驗(yàn)，得到標(biāo)曲，然后再用你的目的蛋白做遷移率實(shí)驗(yàn)，再通過標(biāo)曲找到對應(yīng)的分子量 |
4樓2013-10-23 22:42:04
凌波麗
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