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君揚1989鐵桿木蟲 (著名寫手)
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[求助]
已經(jīng)得到目的基因的全長，現(xiàn)在要PCR將目的基因全長P出來，如何設(shè)計引物？謝謝
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標(biāo)準(zhǔn)的PCR操作程序是將各種所需反應(yīng)成分分別加入PCR反應(yīng)管中，然后根據(jù)具體的實驗要求，設(shè)置一定的循環(huán)參數(shù)，進(jìn)行循環(huán)擴增。具體如下： (1) 向PCR反應(yīng)管中依次加入 DNA模板 50～300ng (約為102～105拷貝DNA) 引物(3'→5'，5'→3')各 2μl 10μmol/L (終濃度為0.4μmol/L) dNTP 2μl 5mmol/L (終濃度為0.2μmol/L) 10×PCR緩沖液 5μl 1/10體積 (終濃度為1×) MgCl2 3μl 25mmol/L (終濃度為1.5mmol/L) 注意的地方： 1. 引物的質(zhì)量是保證PCR特異性的關(guān)鍵，引物過長或過短均會使特異性降低，以18～30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內(nèi)部和引物之間不應(yīng)含有互補序列；引物的堿基順序與非擴增區(qū)域的同源性應(yīng)小于70%；引物的3’末端與模板DNA一定要配對，但末端沒有嚴(yán)格的限制，故引物設(shè)計時可在5’末端加上限制性內(nèi)切酶位點和/或啟動密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產(chǎn)物中的不完整序列、脫嘌呤產(chǎn)物、堿基修飾鏈等“雜質(zhì)”；引物的終濃度一般為0.2～0.5μmol/L，過低會影響反應(yīng)產(chǎn)量，過高會增加引物二聚或錯配的幾率。 |
2樓2013-10-31 12:22:58
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