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林默淚新蟲 (初入文壇)
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[求助]
克隆轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子就是不含目的基因。
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我的目的基因是750bp，質(zhì)粒載體是PET-24a。 我從我?guī)熜值木崛≠|(zhì)粒，然后用KOD酶PCR目的基因。 然后兩步酶切質(zhì)粒和目的基因。NdeI酶切，膠回收，再BamHI酶切，再回收。酶切時(shí)間是3個(gè)小時(shí)以上。 提質(zhì)粒、PCR、回收后都有電泳檢測(cè)，條帶位置正確。 然后用東洋紡的高效鏈接液鏈接目的基因和質(zhì)粒的酶切片段。連接時(shí)間大概時(shí)2個(gè)小時(shí)以上。 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞JM109，熱擊法。 然后培養(yǎng)在含Kan+的平板上。 第一次沒有長(zhǎng)，第二次4個(gè)平板，只有一個(gè)平板上長(zhǎng)了3個(gè)，第三次，4個(gè)平板上都有，每個(gè)大約3—5個(gè)。 PCR檢測(cè)，都沒有P出目的片段。 想請(qǐng)教下各位大神，大概會(huì)是什么問題，那些地方需要改進(jìn)。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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林默淚: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-11-06 19:24:07
gyesang: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-01-27 19:51:56
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我的目的基因是750bp，質(zhì)粒載體是PET-24a。 我從我?guī)熜值木崛≠|(zhì)粒，然后用KOD酶PCR目的基因。 然后兩步酶切質(zhì)粒和目的基因。NdeI酶切，膠回收，再BamHI酶切，再回收。酶切時(shí)間是3個(gè)小時(shí)以上。 提質(zhì)粒、PCR、回收后都有電泳檢測(cè)，條帶位置正確。 然后用東洋紡的高效鏈接液鏈接目的基因和質(zhì)粒的酶切片段。連接時(shí)間大概時(shí)2個(gè)小時(shí)以上。 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞JM109，熱擊法。 然后培養(yǎng)在含Kan+的平板上。 第一次沒有長(zhǎng)，第二次4個(gè)平板，只有一個(gè)平板上長(zhǎng)了3個(gè)，第三次，4個(gè)平板上都有，每個(gè)大約3—5個(gè)。 PCR檢測(cè)，都沒有P出目的片段 從你描述來看,pET載體應(yīng)該是雙酶切完全了.(但是一般情況下要注意 載體上兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間的片段有多長(zhǎng)?膠回收的時(shí)候有沒有看到切出來的片段? 如果載體沒切干凈,那可能會(huì)長(zhǎng)出很多載體自連的假克隆.) 你的問題很可能出在PCR產(chǎn)物的酶切. 首先,你的引物5'端加了保護(hù)堿基嗎?如果沒有,酶切會(huì)變得相對(duì)困難. 第二,BamHI 不太好切, 而且你的酶切時(shí)間是3小時(shí)左右,所以很可能PCR產(chǎn)物上的BamHI沒切動(dòng)或者效率很低. 有一個(gè)麻煩點(diǎn)的辦法是,你先把PCR產(chǎn)物連接到T-載體上,(如果沒有T-載體,隨便找個(gè)載體,,酶切,補(bǔ)平然后去磷,PCR產(chǎn)物加磷,用平末端連接),然后再從T-載體上把你的目的基因用NdeI和BamHI 切下來,這樣做你就能確定目的基因的兩端肯定是切開了的. 如果還長(zhǎng)不出克隆,那就不是酶切,連接的問題了(當(dāng)然,你要確定你的感受態(tài)細(xì)胞是正常的) |
7樓2013-11-06 17:24:24
charles08
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2樓2013-11-04 23:30:40
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林默淚
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4樓2013-11-05 13:34:12
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