 |
 |
 |
| 24小時(shí)熱門版塊排行榜 |
- >論壇更新日志 (5710)
- >考研 (1258)
- >導(dǎo)師招生 (1086)
- >文獻(xiàn)求助 (420)
- >蟲(chóng)友互識(shí) (265)
- >考博 (174)
- >碩博家園 (119)
- >博后之家 (101)
- >基金申請(qǐng) (98)
- >招聘信息布告欄 (81)
- >論文投稿 (81)
- >第一性原理 (65)
- >休閑灌水 (63)
- >教師之家 (60)
- >公派出國(guó) (36)
- >外文書(shū)籍求助 (29)
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 2184 | 回復(fù): 12 | |||
林默淚新蟲(chóng) (初入文壇)
|
[求助]
克隆轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子就是不含目的基因。
|
|
我的目的基因是750bp，質(zhì)粒載體是PET-24a。 我從我?guī)熜值木崛≠|(zhì)粒，然后用KOD酶PCR目的基因。 然后兩步酶切質(zhì)粒和目的基因。NdeI酶切，膠回收，再BamHI酶切，再回收。酶切時(shí)間是3個(gè)小時(shí)以上。 提質(zhì)粒、PCR、回收后都有電泳檢測(cè)，條帶位置正確。 然后用東洋紡的高效鏈接液鏈接目的基因和質(zhì)粒的酶切片段。連接時(shí)間大概時(shí)2個(gè)小時(shí)以上。 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞JM109，熱擊法。 然后培養(yǎng)在含Kan+的平板上。 第一次沒(méi)有長(zhǎng)，第二次4個(gè)平板，只有一個(gè)平板上長(zhǎng)了3個(gè)，第三次，4個(gè)平板上都有，每個(gè)大約3—5個(gè)。 PCR檢測(cè)，都沒(méi)有P出目的片段。 想請(qǐng)教下各位大神，大概會(huì)是什么問(wèn)題，那些地方需要改進(jìn)。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有136人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 大片段基因組DNA克隆，有好方法的進(jìn)來(lái)討論下
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 酵母轉(zhuǎn)化驗(yàn)證方法
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 克隆基因，用PMD19-T載體轉(zhuǎn)天根的感受態(tài)細(xì)胞，菌落少，測(cè)的序列全是空載體，求原因·
已經(jīng)有21人回復(fù)
- 為什么擴(kuò)了一個(gè)抗性基因，連到載體上，這個(gè)基因沒(méi)有表達(dá)呢，跪求各個(gè)大牛指導(dǎo)�。�！
已經(jīng)有17人回復(fù)
- TA克隆電擊法轉(zhuǎn)化的步驟
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 轉(zhuǎn)化后單克隆都一樣嗎
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 長(zhǎng)片段基因3.9K克隆不出來(lái)，求助
已經(jīng)有43人回復(fù)
- pET28a與目的基因連接后轉(zhuǎn)化長(zhǎng)滿菌
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 真菌轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證問(wèn)題
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 目的基因連接到克隆載體后提取質(zhì)粒測(cè)序，序列有問(wèn)題
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 目的基因的連接與轉(zhuǎn)化
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 轉(zhuǎn)化真菌后，怎么鑒定轉(zhuǎn)化子？目的基因是從該真菌克隆出來(lái)的
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 基因工程課程小結(jié)
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 如何把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中？
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 目的基因連接pGEX-6p-1進(jìn)行轉(zhuǎn)化的問(wèn)題
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 親們~誰(shuí)做過(guò)釀酒酵母的轉(zhuǎn)化，怎么篩選陽(yáng)性克隆呢？
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 克隆基因和載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，為什么每次涂板都是空平板沒(méi)有菌落？
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 【求助/交流】大腸桿菌有的是表達(dá)載體的宿主，有些事克隆載體的宿主，他們的區(qū)別在哪?/a>
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【求助/交流】pET29a轉(zhuǎn)化E.coli BL21
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】目的基因克隆總不成功
已經(jīng)有5人回復(fù)
charles08
鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 9 (幼兒園)
- 金幣: 5788.3
- 散金: 2103
- 紅花: 27
- 帖子: 1928
- 在線: 603小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 823046
- 注冊(cè): 2009-08-06
- 性別: GG
- 專業(yè): 植物病理學(xué)
2樓2013-11-04 23:30:40
machao8405
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 11 (小學(xué)生)
- 金幣: 6292
- 散金: 31
- 紅花: 4
- 帖子: 740
- 在線: 216.3小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 884679
- 注冊(cè): 2009-10-26
- 性別: GG
- 專業(yè): 植物學(xué)
3樓2013-11-04 23:33:51
林默淚
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 327.3
- 帖子: 48
- 在線: 19.7小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2323986
- 注冊(cè): 2013-03-06
- 專業(yè): 生物化學(xué)
4樓2013-11-05 13:34:12
林默淚
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 327.3
- 帖子: 48
- 在線: 19.7小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2323986
- 注冊(cè): 2013-03-06
- 專業(yè): 生物化學(xué)
5樓2013-11-05 13:35:59
charles08
鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 9 (幼兒園)
- 金幣: 5788.3
- 散金: 2103
- 紅花: 27
- 帖子: 1928
- 在線: 603小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 823046
- 注冊(cè): 2009-08-06
- 性別: GG
- 專業(yè): 植物病理學(xué)
6樓2013-11-05 16:29:35
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
林默淚: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-11-06 19:24:07
gyesang: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-01-27 19:51:56
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
林默淚: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-11-06 19:24:07
gyesang: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-01-27 19:51:56
|
我的目的基因是750bp，質(zhì)粒載體是PET-24a。 我從我?guī)熜值木崛≠|(zhì)粒，然后用KOD酶PCR目的基因。 然后兩步酶切質(zhì)粒和目的基因。NdeI酶切，膠回收，再BamHI酶切，再回收。酶切時(shí)間是3個(gè)小時(shí)以上。 提質(zhì)粒、PCR、回收后都有電泳檢測(cè)，條帶位置正確。 然后用東洋紡的高效鏈接液鏈接目的基因和質(zhì)粒的酶切片段。連接時(shí)間大概時(shí)2個(gè)小時(shí)以上。 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞JM109，熱擊法。 然后培養(yǎng)在含Kan+的平板上。 第一次沒(méi)有長(zhǎng)，第二次4個(gè)平板，只有一個(gè)平板上長(zhǎng)了3個(gè)，第三次，4個(gè)平板上都有，每個(gè)大約3—5個(gè)。 PCR檢測(cè)，都沒(méi)有P出目的片段 從你描述來(lái)看,pET載體應(yīng)該是雙酶切完全了.(但是一般情況下要注意 載體上兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間的片段有多長(zhǎng)?膠回收的時(shí)候有沒(méi)有看到切出來(lái)的片段? 如果載體沒(méi)切干凈,那可能會(huì)長(zhǎng)出很多載體自連的假克隆.) 你的問(wèn)題很可能出在PCR產(chǎn)物的酶切. 首先,你的引物5'端加了保護(hù)堿基嗎?如果沒(méi)有,酶切會(huì)變得相對(duì)困難. 第二,BamHI 不太好切, 而且你的酶切時(shí)間是3小時(shí)左右,所以很可能PCR產(chǎn)物上的BamHI沒(méi)切動(dòng)或者效率很低. 有一個(gè)麻煩點(diǎn)的辦法是,你先把PCR產(chǎn)物連接到T-載體上,(如果沒(méi)有T-載體,隨便找個(gè)載體,,酶切,補(bǔ)平然后去磷,PCR產(chǎn)物加磷,用平末端連接),然后再?gòu)腡-載體上把你的目的基因用NdeI和BamHI 切下來(lái),這樣做你就能確定目的基因的兩端肯定是切開(kāi)了的. 如果還長(zhǎng)不出克隆,那就不是酶切,連接的問(wèn)題了(當(dāng)然,你要確定你的感受態(tài)細(xì)胞是正常的) |
7樓2013-11-06 17:24:24
liaohongbin
金蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 533.5
- 帖子: 47
- 在線: 87.8小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1332790
- 注冊(cè): 2011-06-28
- 性別: GG
- 專業(yè): 金屬結(jié)構(gòu)材料
8樓2013-11-06 17:32:56
林默淚
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 327.3
- 帖子: 48
- 在線: 19.7小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2323986
- 注冊(cè): 2013-03-06
- 專業(yè): 生物化學(xué)
9樓2013-11-06 19:14:08
林默淚
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 327.3
- 帖子: 48
- 在線: 19.7小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2323986
- 注冊(cè): 2013-03-06
- 專業(yè): 生物化學(xué)
10樓2013-11-06 19:24:40
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 林默淚 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研]
 材料考研調(diào)劑生
+3
|
黃粱一夢(mèng)千年 2026-03-24 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研]
085602 289分求調(diào)劑
+4
|
WWW西西弗斯 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考博] 申博26年 +4 | 八6八68 2026-03-19 | 4/200 |
|
|
|
[材料工程] 一志愿C9材料與化工專業(yè)總分300求調(diào)劑 +4 | 曼111 2026-03-24 | 5/250 |
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +7 | 某某某某位 2026-03-21 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 344求調(diào)劑 +3 | desto 2026-03-24 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +7 | 十三加油 2026-03-21 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 361求調(diào)劑 +3 | Glack 2026-03-22 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 考研化學(xué)308分求調(diào)劑 +7 | 你好明天你好 2026-03-23 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 生物學(xué)一志愿985，分?jǐn)?shù)349求調(diào)劑 +6 | zxts12 2026-03-21 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 328求調(diào)劑，英語(yǔ)六級(jí)551，有科研經(jīng)歷 +7 | 生物工程調(diào)劑 2026-03-17 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +3 | 26研0 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考博] 招收博士1-2人 +3 | QGZDSYS 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 286求調(diào)劑 +10 | Faune 2026-03-21 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 初試 317 +7 | 半拉月丙 2026-03-20 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | .m.. 2026-03-21 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | 白QF 2026-03-21 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 295求調(diào)劑 +4 | 一志愿京區(qū)211 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 招收調(diào)劑碩士 +4 | lidianxing 2026-03-19 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 一志愿福大288有機(jī)化學(xué)，求調(diào)劑 +3 | 小木蟲(chóng)200408204 2026-03-18 | 3/150 |
|