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克隆轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子就是不含目的基因。
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我的目的基因是750bp，質(zhì)粒載體是PET-24a。 我從我?guī)熜值木崛≠|(zhì)粒，然后用KOD酶PCR目的基因。 然后兩步酶切質(zhì)粒和目的基因。NdeI酶切，膠回收，再BamHI酶切，再回收。酶切時間是3個小時以上。 提質(zhì)粒、PCR、回收后都有電泳檢測，條帶位置正確。 然后用東洋紡的高效鏈接液鏈接目的基因和質(zhì)粒的酶切片段。連接時間大概時2個小時以上。 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞JM109，熱擊法。 然后培養(yǎng)在含Kan+的平板上。 第一次沒有長，第二次4個平板，只有一個平板上長了3個，第三次，4個平板上都有，每個大約3—5個。 PCR檢測，都沒有P出目的片段。 想請教下各位大神，大概會是什么問題，那些地方需要改進。 |
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