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林默淚新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
克隆轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子就是不含目的基因。
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我的目的基因是750bp，質(zhì)粒載體是PET-24a。 我從我?guī)熜值木崛≠|(zhì)粒，然后用KOD酶PCR目的基因。 然后兩步酶切質(zhì)粒和目的基因。NdeI酶切，膠回收，再BamHI酶切，再回收。酶切時(shí)間是3個(gè)小時(shí)以上。 提質(zhì)粒、PCR、回收后都有電泳檢測(cè)，條帶位置正確。 然后用東洋紡的高效鏈接液鏈接目的基因和質(zhì)粒的酶切片段。連接時(shí)間大概時(shí)2個(gè)小時(shí)以上。 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞JM109，熱擊法。 然后培養(yǎng)在含Kan+的平板上。 第一次沒(méi)有長(zhǎng)，第二次4個(gè)平板，只有一個(gè)平板上長(zhǎng)了3個(gè)，第三次，4個(gè)平板上都有，每個(gè)大約3—5個(gè)。 PCR檢測(cè)，都沒(méi)有P出目的片段。 想請(qǐng)教下各位大神，大概會(huì)是什么問(wèn)題，那些地方需要改進(jìn)。 |
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林默淚
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charles08
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3樓2013-11-04 23:33:51
林默淚
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