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onizukacus

金蟲 (初入文壇)

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[求助] 測(cè)序結(jié)果的問題

我做了一批PCR的樣品進(jìn)行測(cè)序，用的引物是ITS1Pl （TCCGTAGGTGAACCTGCGGA）ITS1P2（GCTGCGTTCTTCATCGATGC），ITS2P1（GCATCGATGAAGAACGCAGC），ITS2P2（TCCTCCGCTTATTGATATGC），等測(cè)序結(jié)果出來后，測(cè)序方返回給我的是拼接結(jié)果，可我怎么都不能在結(jié)果中找到我的引物序列，然后我電話咨詢后說的是拼接結(jié)果無引物序列，求助各位高手啊，那我怎么在一段拼接序列中分辨出哪一段是ITS1Pl和ITS1P2，哪一段是ITS2P1和ITS2P2還有5末端的基因序列啊

求助啊啊啊

這是我的一個(gè)拼接結(jié)果
TGGTAAGTAAAAATCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGAGACCGAAAATATCGAGCGAT
TCGGAGAACCCGTGAATAAGTGGCGGCGGTTGCTGCCGCAGAACAGCCATCCCAGTCGCCGCCTCGTCTCCTTCAGGGGG
GGCGGGGGCACGATGAAGGATGGATGAAAACTCAAACCGGCGCAGCTCCGCGCCAAGGGTATGTAGAGACGCGAGCCCTG
CAACGGGTTCAGTGGCGTGGAGTGCTGTCGCACACCATGTGGATTATAACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCT
CGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCA
AGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCGTTGCGTCGCTCCGTGCCGACTCCGTCCC
ACAAACGCGTGCGCCGGCGTCGGCTCGGACGTGAAGAGTGGCTCGTCGTGCCCATCGGTGCGGCGGGCTCAAGAGCGGGT
TATCGTCTCGTCGGCCGGCAACAACAAGGGGTGGATGAAAGCTGTGAGCAGAAAGCCTGCGTTGTTTCTTGCTCGGCCCG
AGGAAAGATTACATATTTCAAGGTGATCCCAGCCCATGCGCCGATCCACAGGCGGCGGCTTGGAATGCGACCCCAGGATG
GGCGAGGCCACCCGCCGAGTTTAAGCATATCAATA

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1樓 2013-11-05 09:25:58

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ccp2012

新蟲 (初入文壇)

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+10, 鼓勵(lì)交流！ 2013-11-07 15:54:01
gyesang: 回帖置頂 2013-11-07 15:54:12

PCR測(cè)序拼接結(jié)果里面是沒有引物序列的，用PCR引物作為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序時(shí)，所測(cè)序列是從引物3’末端后第一個(gè)堿基開始的，所以自然就找不到您的引物序列了。有兩種方法可以得到您的引物序列。對(duì)于較短PC產(chǎn)物（<800bp），可以用另一端的引物進(jìn)行測(cè)序，從另一端測(cè)序可以一直測(cè)到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互補(bǔ)序列。對(duì)于較長(zhǎng)的序列，一個(gè)測(cè)序反應(yīng)測(cè)不到頭，因此就只能將您的PCR產(chǎn)物片段克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中，用載體上的通用引物進(jìn)行測(cè)序。由于載體上的通用引物與您的插入序列之間還有一段距離，因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在測(cè)序的起始端總會(huì)有一些堿基無法準(zhǔn)確讀出，因此您如果想得到您PCR產(chǎn)物的完整序列，最好克隆后進(jìn)行測(cè)序。

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9樓2013-11-07 10:57:40

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yang0071

木蟲 (職業(yè)作家)

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【答案】應(yīng)助回帖

★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩。 2013-11-05 11:33:44

你先把pcr產(chǎn)物連接到載體上
要求公司整個(gè)樣品測(cè)通
讓公司把原始序列和拼接序列發(fā)給你再比對(duì)

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2樓2013-11-05 11:29:32

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沙門小rna

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

直接把你pcr的序列和測(cè)序回來的結(jié)果放到blast 里面。兩兩比對(duì)。3秒鐘解決測(cè)序比對(duì)~

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應(yīng)助之星就是我~沒錯(cuò)。你沒有看錯(cuò)~

3樓2013-11-05 12:29:07

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onizukacus

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3樓: Originally posted by 沙門小rna at 2013-11-05 12:29:07
直接把你pcr的序列和測(cè)序回來的結(jié)果放到blast 里面。兩兩比對(duì)。3秒鐘解決測(cè)序比對(duì)~

你好，我不加進(jìn)去ID是99%，我加進(jìn)去了還是99%。。這什么情況啊請(qǐng)問。還有事隨便插入嗎

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4樓2013-11-06 08:36:35

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2樓: Originally posted by yang0071 at 2013-11-05 11:29:32
你先把pcr產(chǎn)物連接到載體上
要求公司整個(gè)樣品測(cè)通
讓公司把原始序列和拼接序列發(fā)給你再比對(duì)

我打過電話了，他們說就這有這個(gè)，，那我該怎么辦��？

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5樓2013-11-06 08:37:14

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gyesang

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

對(duì)測(cè)序缺乏基本了解，一般測(cè)序時(shí)，引物及引物后面的50個(gè)堿基都是不準(zhǔn)的，你用PCR時(shí)的引物測(cè)序，在測(cè)序結(jié)果中當(dāng)然是找不到引物序列的

2樓正解！

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6樓2013-11-06 10:23:45

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6樓: Originally posted by gyesang at 2013-11-06 10:23:45
對(duì)測(cè)序缺乏基本了解，一般測(cè)序時(shí)，引物及引物后面的50個(gè)堿基都是不準(zhǔn)的，你用PCR時(shí)的引物測(cè)序，在測(cè)序結(jié)果中當(dāng)然是找不到引物序列的

2樓正解！

我是做植化的，突然被抽來做DNA，頭大啊，我已經(jīng)打過電話了，測(cè)序方說沒有那怎么辦啦

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7樓2013-11-07 08:38:59

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請(qǐng)問下，我這測(cè)序結(jié)果不是應(yīng)該有3段嗎，1Pl段，1P2段，5末端段，請(qǐng)問下這怎么區(qū)分，我查了文獻(xiàn)后都沒找到

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8樓2013-11-07 08:49:11

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8樓: Originally posted by onizukacus at 2013-11-07 08:49:11
請(qǐng)問下，我這測(cè)序結(jié)果不是應(yīng)該有3段嗎，1Pl段，1P2段，5末端段，請(qǐng)問下這怎么區(qū)分，我查了文獻(xiàn)后都沒找到...

不明白你講的這些啊

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10樓2013-11-07 15:53:43

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