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檸檬可樂星

新蟲 (小有名氣)

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[求助] 為什么不能用PCR克隆之后再PCR的陽性產(chǎn)物直接測(cè)序？

各位大俠：本人剛開始學(xué)做分子，菜鳥一枚。之前PCR得到的產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果不好，想做一下克隆。我看克隆的操作步驟中，挑取一些單克隆做菌落PCR，然后PCR結(jié)果為陽性的菌落再培養(yǎng)，拿養(yǎng)好的菌液送測(cè)序。
我不是很了解菌液測(cè)序的原理，很好奇為什么不能用結(jié)果為陽性的菌落PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，而是要再養(yǎng)菌，用菌液測(cè)序呢？
多謝指點(diǎn)！

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1樓 2013-12-04 19:59:02

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cicelyzh

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
檸檬可樂星: 金幣+5, ★★★★★最佳答案, 解釋的非常詳細(xì) 多謝 2013-12-05 08:22:43

PCR說白了就是體外復(fù)制DNA，會(huì)有出錯(cuò)的可能，尤其是PCR條件控制不嚴(yán)格的時(shí)候。細(xì)菌的DNA復(fù)制有嚴(yán)格的控制機(jī)理，尤其是用于克隆的工程菌株，質(zhì)粒的復(fù)制幾乎可以說不會(huì)出錯(cuò)。你已經(jīng)克隆到菌里，目的是測(cè)定載體里攜帶的序列是否正確，用PCR產(chǎn)物測(cè)序如果出錯(cuò)可能是做菌落PCR時(shí) 的錯(cuò)誤，你仍然無法得知克隆的序列是否正確。用菌液測(cè)序是公司自己從菌里提模板進(jìn)行測(cè)序，避免PCR獲取模板時(shí)可能出現(xiàn)的錯(cuò)配。

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回復(fù)此樓

2樓2013-12-05 07:44:02

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