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H-xiangzhu金蟲 (正式寫手)
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急！PCR產(chǎn)物測(cè)序找不到引物 已有1人參與
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| 我想做放線菌的16rDNA鑒定，先提取總DNA，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，引物采用細(xì)菌通用引物，大小在1500bp這樣，但是測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)找不到因?yàn)樾蛄�，�?qǐng)問(wèn)我該怎么辦呢？是什么問(wèn)題呢？請(qǐng)高手幫忙。非常感謝！ |
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lihongbo840427
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-01-05 17:30:05
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| 不用客氣的。如果要求很嚴(yán)苛，想要得到的數(shù)據(jù)用來(lái)發(fā)表，還是做克隆吧。不做克隆是無(wú)法得到全長(zhǎng)的16s rRNA序列的。如果只是用來(lái)鑒定均屬的話，雙向測(cè)序的結(jié)果拼接重合的部分的可信度最高，選取這部分去NCBI進(jìn)行blast就能比對(duì)出菌屬了。選取的比對(duì)序列長(zhǎng)度越長(zhǎng)，得到的結(jié)果中越準(zhǔn)確，大于95%的就可以認(rèn)為是同屬了。 |
10樓2013-01-05 15:47:25
cicelyzh
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3樓2012-12-31 11:34:09
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4樓2013-01-02 22:03:18
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+4, 歡迎應(yīng)助 2013-01-05 17:31:20
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你的PCR產(chǎn)物是1500bp的，測(cè)序圖片的前100bp的峰都不可信，最后面的電泳峰（800bp以后）峰的信噪比比較低，大峰下面套小峰，都不能認(rèn)為測(cè)到的序列。 如果你想在測(cè)序結(jié)果中找到引物序列（用上游引物測(cè)序的話，測(cè)序的結(jié)果最后的一段序列中只能找到與下游引物的反向互補(bǔ)序列一致的堿基；反之用下游引物測(cè)序，只能找到上游引物的反向互補(bǔ)序列），這是在你測(cè)得的序列可信的情況下才能得到的結(jié)果。你的PCR產(chǎn)物送去測(cè)序，測(cè)得的序列絕對(duì)不可能得到1500bp的結(jié)果的。 所以講了這么一大堆，如果你想要從測(cè)序結(jié)果中得到引物序列，一個(gè)辦法是分段測(cè)序，分三段，每500bp測(cè)一個(gè)，這樣得到的序列3個(gè)拼接起來(lái)就能得到很好的結(jié)果了，也能找到你的引物序列了。 |
6樓2013-01-04 15:33:00
H-xiangzhu
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7樓2013-01-05 13:41:59
lihongbo840427
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小丹木木: 金幣+4, 鼓勵(lì) 應(yīng)助 2013-01-05 17:31:36
小丹木木: 金幣+4, 鼓勵(lì) 應(yīng)助 2013-01-05 17:31:36
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雙向測(cè)通是可以的，所得到的序列可信度是可以的，但也有可能沒有你想要看到的引物序列（并不代表你的測(cè)序結(jié)果失敗啊）。你最好詳細(xì)咨詢下測(cè)序公司的技術(shù)支持，把你的需求跟他們講下。其實(shí)測(cè)通就是雙向測(cè)序結(jié)果的數(shù)據(jù)，他們幫忙拼接好。你也可以自己拼接用Chromas來(lái)看峰形，用ContigExpress來(lái)做拼接。不可靠序列通過(guò)看峰形手工切掉。 你只要記住現(xiàn)在DNA測(cè)序一個(gè)反應(yīng)也就能測(cè)500bp左右。通用引物1492r/F27，pcr后去測(cè)序，因?yàn)闇y(cè)序軟件的自身原因，測(cè)出來(lái)開頭的序列是雜帶不準(zhǔn)確，如果需要16sRNA的全長(zhǎng)，必須做TA克隆，就需要載體。如果你要求鑒定菌種只到屬，就沒必要克隆了。 你可以選擇27F做上游引物，534r做下游引物，PCR一次得到500bp左右的產(chǎn)物，雙向測(cè)序就能得到前500bp的準(zhǔn)確序列了，以此再找一個(gè)16srRNA位置在1000左右的引物序列，3個(gè)500bp的PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序就能完美的得到你的整條16srRNA序列了。 |
8樓2013-01-05 15:23:48
H-xiangzhu
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9樓2013-01-05 15:31:44
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