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H-xiangzhu金蟲 (正式寫手)
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[求助]
急！PCR產(chǎn)物測序找不到引物 已有1人參與
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| 我想做放線菌的16rDNA鑒定，先提取總DNA，PCR產(chǎn)物直接測序，引物采用細菌通用引物，大小在1500bp這樣，但是測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)找不到因為序列，請問我該怎么辦呢？是什么問題呢？請高手幫忙。非常感謝！ |
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lihongbo840427
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【答案】應(yīng)助回帖
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你的PCR產(chǎn)物是1500bp的，測序圖片的前100bp的峰都不可信，最后面的電泳峰（800bp以后）峰的信噪比比較低，大峰下面套小峰，都不能認為測到的序列。 如果你想在測序結(jié)果中找到引物序列（用上游引物測序的話，測序的結(jié)果最后的一段序列中只能找到與下游引物的反向互補序列一致的堿基；反之用下游引物測序，只能找到上游引物的反向互補序列），這是在你測得的序列可信的情況下才能得到的結(jié)果。你的PCR產(chǎn)物送去測序，測得的序列絕對不可能得到1500bp的結(jié)果的。 所以講了這么一大堆，如果你想要從測序結(jié)果中得到引物序列，一個辦法是分段測序，分三段，每500bp測一個，這樣得到的序列3個拼接起來就能得到很好的結(jié)果了，也能找到你的引物序列了。 |
6樓2013-01-04 15:33:00
H-xiangzhu
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7樓2013-01-05 13:41:59
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+4, 鼓勵 應(yīng)助 2013-01-05 17:31:36
小丹木木: 金幣+4, 鼓勵 應(yīng)助 2013-01-05 17:31:36
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雙向測通是可以的，所得到的序列可信度是可以的，但也有可能沒有你想要看到的引物序列（并不代表你的測序結(jié)果失敗�。�。你最好詳細咨詢下測序公司的技術(shù)支持，把你的需求跟他們講下。其實測通就是雙向測序結(jié)果的數(shù)據(jù)，他們幫忙拼接好。你也可以自己拼接用Chromas來看峰形，用ContigExpress來做拼接。不可靠序列通過看峰形手工切掉。 你只要記住現(xiàn)在DNA測序一個反應(yīng)也就能測500bp左右。通用引物1492r/F27，pcr后去測序，因為測序軟件的自身原因，測出來開頭的序列是雜帶不準(zhǔn)確，如果需要16sRNA的全長，必須做TA克隆，就需要載體。如果你要求鑒定菌種只到屬，就沒必要克隆了。 你可以選擇27F做上游引物，534r做下游引物，PCR一次得到500bp左右的產(chǎn)物，雙向測序就能得到前500bp的準(zhǔn)確序列了，以此再找一個16srRNA位置在1000左右的引物序列，3個500bp的PCR產(chǎn)物雙向測序就能完美的得到你的整條16srRNA序列了。 |
8樓2013-01-05 15:23:48
H-xiangzhu
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