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[求助]
鏈霉菌基因組DNA的大提
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我有幾株鏈霉菌想要提取基因組DNA后做雜交，大提DNA的方法是改良的CTAB法，最后雖然提取的量比較少，但是能用玻璃棒攪絲，之后用70%的乙醇洗鹽，再之后風(fēng)干（風(fēng)干徹底），再之后用0.1xSSC溶解，卻溶解不了，SSC是最新配制的，而且第一次提取的時(shí)候出現(xiàn)不溶解的情況，又重新配制了ssc···第二次還是不溶解。求大神指導(dǎo)。 或者哪位大神之前大提過(guò)鏈霉菌的DNA，求方法啊，我已經(jīng)提了一個(gè)多月了，真心已經(jīng)黔驢技窮了··· |
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taoway
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另外，我們長(zhǎng)期提取鏈霉菌總DNA都是用溶菌酶方法提取的，你也可以試一下用此法小量提取下gDNA。 1. 取一干凈Ep管，添加30 ul菌絲體至500 ul SET buffer，加10 ul Lysozyme solution (50 mg/ml)，混勻后37℃ 水浴30 min； 2. 加14 ul proteinase K solution (20 mg/ml), 混勻后添加60 ul 10% SDS溶液，混勻，55℃水浴1h； 3. 加200 ul 5 M NaCl solution并混合均勻； 4. 加500 ul酚仿溶液（Phenol/chloroform/isoamylol=25:24:1），混勻后高速離心，12000 rpm離心10 min； 5. 上清轉(zhuǎn)移至干凈的Ep管，加500 ul氯仿，混勻后高速離心； 6. 移取上清至干凈Ep管，添加0.6 倍異戊醇，混勻后高速離心； 7. 棄上清，加1 ml 70% 乙醇，重懸DNA，12000 rpm 離心10 min； 8. 重復(fù)步驟7洗滌gDNA； 9. 將gDNA用水溶解。 SET buffer: NaCl 75 mM EDTA (pH8.0) 25 mM Tris-Cl (pH7.5) 20 mM 注意：菌絲體的量和其他試劑用量都可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)，還有樣品處理時(shí)間要根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)，一般都會(huì)有所延長(zhǎng)。 希望你能順利解決這一問(wèn)題！ |
9樓2013-12-24 09:46:09
【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
laozuzunzhe: 金幣+4, good！ 2013-12-23 21:38:05
dgm1208: 金幣+30, ★★★很有幫助, 謝謝你哈，之前由于操作失誤把之前的100金幣都給了bikexmx，又追加的，金幣不多，謝謝你 2013-12-26 18:19:51
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方法一：如果這種菌能長(zhǎng)成菌落 ，你就用寶生物的這個(gè)試劑盒來(lái)提一下（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR），這個(gè)很便宜。 方法二：如果這個(gè)試劑盒不可以的話，你就用德國(guó)QIAGEN的試劑盒，這個(gè)大約1500，有點(diǎn)貴。 這些應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題，你試試吧。 希望能幫到你 |
2樓2013-12-23 21:13:54
taoway
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3樓2013-12-23 22:04:00
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dgm1208: 金幣+70, ★★★★★最佳答案, 謝謝你哈，之前由于操作失誤把之前的100金幣都給了bikexmx，又追加的，金幣不多，謝謝你 2013-12-26 18:19:04
dgm1208: 金幣+70, ★★★★★最佳答案, 謝謝你哈，之前由于操作失誤把之前的100金幣都給了bikexmx，又追加的，金幣不多，謝謝你 2013-12-26 18:19:04
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不好意思，剛才在路上用手機(jī)回復(fù)的，發(fā)現(xiàn)全是亂碼。 我感覺(jué)你的問(wèn)題出在DNA風(fēng)干，我們實(shí)驗(yàn)室提取鏈霉菌總DNA后，用75%乙醇脫鹽兩次，然后稍稍spin一下用移液槍吸掉液體，敞口在超凈臺(tái)或工作臺(tái)面放置幾分鐘至聞不到乙醇味道，隨后加水或TE溶解DNA�；靹蛞幌略�55度水浴鍋內(nèi)放置5-10分鐘促溶一下就可以了。注意一定不要將總DNA完全風(fēng)干！祝好運(yùn)！ |
4樓2013-12-23 22:36:06
5樓2013-12-24 08:48:25
6樓2013-12-24 08:49:45
【答案】應(yīng)助回帖
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dgm1208: 金幣+100, ★有幫助, 10 2013-12-25 21:09:23
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| 跑電泳沒(méi)有條帶嗎？個(gè)人認(rèn)為可能是樣品里還存有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，可以再用氯仿-異戊醇抽提一下，樓主用的是什么方法提的，我們實(shí)驗(yàn)室一般用CTAB法，可以讓溶菌酶和蛋白酶多反應(yīng)一會(huì)，去除多余雜質(zhì)，希望對(duì)你有幫助 |
7樓2013-12-24 09:17:12
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8樓2013-12-24 09:34:28
10樓2013-12-24 11:54:53
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