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一休陳金蟲 (正式寫手)
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[求助]
關(guān)于二倍體釀酒酵母基因敲除的疑問 已有2人參與
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各位蟲友大家新年好。 我最近開始做二倍體釀酒酵母基因的敲除工作，現(xiàn)在遇到兩個(gè)疑問：其一，構(gòu)建一個(gè)（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，一次轉(zhuǎn)化，有沒有可能將兩個(gè)等位基因同時(shí)敲除？這樣的話，我用菌落PCR驗(yàn)證，P不出來(lái)目的基因條帶的且?guī)в蠫418抗性的菌落豈不就是敲除的陽(yáng)性菌落？ 其二，如果第一點(diǎn)不成立，即是一個(gè)敲除盒經(jīng)過一次轉(zhuǎn)化只能敲除一個(gè)等位基因的話，第二個(gè)基因我怎么敲除呢？還望有二倍體釀酒酵母敲除經(jīng)驗(yàn)的蟲友們多多指教！再次祝福大家新年快樂，馬年龍馬精神，百尺竿頭，更進(jìn)一步！謝謝。 |
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yuanbo934
至尊木蟲 (著名寫手)
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3樓2014-02-13 15:21:40
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一休陳
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4樓2014-02-13 15:23:46
一休陳
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那請(qǐng)問我首先通過構(gòu)建一個(gè)（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次轉(zhuǎn)化敲除一個(gè)等位基因；然后構(gòu)建根據(jù)目的基因序列，構(gòu)建一個(gè)(“ATG...NNNN同源臂+"UAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA"+"NNNNNN...UAA同源臂"這個(gè)一個(gè)同源重組組件，通過轉(zhuǎn)化——同源重組，插入一個(gè)UAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA若干個(gè)的片段起到破壞原有基因的目的，這樣，可行性有如何呢？ |
5樓2014-02-13 15:37:32
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