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keven7928至尊木蟲 (知名作家)
水手
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[求助]
細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率很低 已有1人參與
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| 自己合成的一個(gè)陽離子高分子材料，與DNA在質(zhì)量比5：1的條件下就有很好結(jié)合，但是做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，不論5：1, 10:1, 20:1, 30:1 在腫瘤細(xì)胞上幾乎沒有轉(zhuǎn)染，請(qǐng)問什么原因？ |
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我聽五月天
木蟲 (正式寫手)
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- 專業(yè): 抗腫瘤藥物藥理
3樓2014-03-15 11:10:38
yipan 
銅蟲 (職業(yè)作家)
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- 專業(yè): 整合生物學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
keven7928: 金幣+2, ★有幫助 2014-03-14 10:00:58
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
keven7928: 金幣+2, ★有幫助 2014-03-14 10:00:58
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轉(zhuǎn)染效率收多種因素影響，主要因素有下面幾個(gè)： 1. 細(xì)胞培養(yǎng)物 健康的細(xì)胞培養(yǎng)物是成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。不同細(xì)胞有不同的培養(yǎng)基，血清和添加物。低的 細(xì)胞代數(shù)（<50）能確保基因型不變。高的轉(zhuǎn)染效率需要一定的細(xì)胞密度，一般的轉(zhuǎn)染試劑 都會(huì)有專門的說明。推薦在轉(zhuǎn)染前24 小時(shí)分細(xì)胞，這將提供正常細(xì)胞代謝，增加對(duì)外源DNA 攝入的可能。一定要避免細(xì)菌，支原體或真菌的污染。 2. 血清 大多數(shù)培養(yǎng)基在使用前需要加血清。胎牛血清（FCS）經(jīng)常用到，便宜一點(diǎn)的有馬或牛血清。 通常的，血清是一種包含生長(zhǎng)因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對(duì)不同細(xì)胞的生 長(zhǎng)作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響轉(zhuǎn)染效率。因此在轉(zhuǎn)染前建議先測(cè)(轉(zhuǎn)右) 試出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)良好的血清批號(hào)，轉(zhuǎn)染時(shí)用同一批號(hào)的血清，并同時(shí)做負(fù)對(duì)照（不加轉(zhuǎn)染試 劑及外源DNA）以測(cè)試細(xì)胞生長(zhǎng)是否正常。有些轉(zhuǎn)染技術(shù)如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在情況下 效率很低，因此在轉(zhuǎn)染前要除血清。但有些對(duì)此敏感的細(xì)胞如原代細(xì)胞會(huì)受到損傷，甚至死 亡導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。 3. 載體構(gòu)建 轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR 產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。 病毒載體對(duì)特定宿主細(xì)胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定 的細(xì)胞周期，如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細(xì)胞，此外還需考慮一些安全問題（如基因 污染）。除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)及大小對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響，如前面提到的超螺 旋及線性DNA 對(duì)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進(jìn)行， 因此選擇組成或可調(diào)控，強(qiáng)度合適的啟動(dòng)子也很重要，同時(shí)做空載體及其它基因的相同載體 構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對(duì)照可排除毒性影響的干擾。 4. DNA 質(zhì)量 DNA 質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原理， 如果DNA 不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成 及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。核酸純化世界第一品牌德國(guó)QIAGEN 公司提供的超純質(zhì)粒抽提試劑盒，能達(dá) 到兩倍2x CsCl 梯度離心以上的純度效果，使您不必為DNA 質(zhì)量操心。此外，對(duì)一些內(nèi)毒素 敏感的細(xì)胞（如原代細(xì)胞，懸浮細(xì)胞和造血細(xì)胞），QIAGEN 還提供可去除內(nèi)毒素污染的質(zhì) 粒抽提試劑盒，在質(zhì)粒抽提過程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉(zhuǎn)染效果。 5.轉(zhuǎn)染技術(shù) 轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA 與轉(zhuǎn)染試劑比例， 細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間等。 |
2樓2014-03-14 08:47:27
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