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qianbudiaoa新蟲 (初入文壇)
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[求助]
原核表達(dá)蛋白量很低 已有6人參與
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原核表達(dá)融合蛋白量很低,不知道是什么原因.嘗試過(guò)很多優(yōu)化表達(dá)條件的方法都不行,不知道是不是存在其他表達(dá)量低的原因,求指教. 先簡(jiǎn)單介紹下我表達(dá)的信息吧：載體是pet—28a（+），表達(dá)菌株為BL21 ，沒有信號(hào)肽序列，蛋白為包涵體形式存在于沉淀中，帶有his標(biāo)簽， 再介紹下我表達(dá)的方法：提前一晚?yè)u菌，第二天轉(zhuǎn)接，到OD0.8 時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)過(guò)夜，離心后倒掉上清，pbs懸浮沉淀后-80度冰箱凍存一夜，第二天加溶菌酶孵化2小時(shí)，超聲破碎，離心后沉淀用wash buffer洗滌后離心，得到的沉淀重懸于2M尿素的PBS中，-20度凍存2~3h，然后跑SDSPAGE電泳，結(jié)果是蛋白表達(dá)量很低。 以下說(shuō)說(shuō)我做過(guò)的嘗試:不同溫度誘導(dǎo),37度,30度,25度都做過(guò),37度完全沒有表達(dá),30度和25度表達(dá)量很低而且差不多. 不同IPTG濃度誘導(dǎo)，0，50，100，200，300，400mM /ml 濃度梯度25度誘導(dǎo)過(guò)夜，都有表達(dá)但是表達(dá)量都很低而且沒有明顯差異。 誘導(dǎo)時(shí)間，4h，8h，12h，16h，24h都做過(guò)，表達(dá)量還是都很低，也看不出來(lái)時(shí)間不夠還是時(shí)間太長(zhǎng)蛋白降解了。 還有一個(gè)轉(zhuǎn)速的問(wèn)題，只用過(guò)250rpm，不知道降低轉(zhuǎn)速會(huì)不會(huì)有影響，打算下個(gè)星期嘗試一下。 實(shí)在是不知道為什么表達(dá)量很低了，問(wèn)了身邊的很多人，方法都嘗試過(guò)了，還是沒有進(jìn)展，求做過(guò)類似實(shí)驗(yàn)，遇到過(guò)類似問(wèn)題的能給我指導(dǎo)一下，不勝感激。 |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 蛋白表達(dá)純化鑒定精華 |
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9樓2014-04-03 13:24:56
句號(hào)123 
新蟲 (初入文壇)
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2樓2014-03-16 21:49:24
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
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youlinglyw: 金幣+2, 感謝經(jīng)驗(yàn)分享 2014-03-18 17:15:24
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在不更換載體的表達(dá)菌株的情況下，看你已經(jīng)優(yōu)化了表達(dá)溫度，IPTG濃度等 還可以優(yōu)化的有： 1. 提高誘導(dǎo)的OD，看你是包涵體表達(dá)，所以可以嘗試OD1.0 或者1.2進(jìn)行誘導(dǎo) 2. 優(yōu)化培養(yǎng)基，一個(gè)是采用富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，如TB(Terrific Broth)等，另一個(gè)是更換培養(yǎng)基的碳源，向培養(yǎng)基中加入甘油等 3. 還有就是你有沒有分析過(guò)蛋白的編碼序列，是不是稀有密碼子過(guò)多？如果稀有密碼子多的話，可以更換表達(dá)菌株，變?yōu)镽osseta，或者進(jìn)行密碼子優(yōu)化（點(diǎn)突變或者全基因合成） |
3樓2014-03-17 10:30:43
wh6125
鐵蟲 (初入文壇)
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4樓2014-03-17 13:36:27
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