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Yocan2012

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[求助] 植物基因組提取已有4人參與

最近在做植物基因組提取，用來(lái)測(cè)序建庫(kù)使用的。使用的是植物（菊科）的種子作為材料，液氮研磨破碎，CTAB法提取，除了沒(méi)有使用Tris飽和酚外，其他完全按照CTAB法進(jìn)行操作。結(jié)果見(jiàn)圖。此外，有時(shí)候提取到的只有250 bp大小的片段，有的時(shí)候根本什么也提取不到。但是，在年前做預(yù)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候提取的效果是非常好的，20 kb的條帶非常好。現(xiàn)在卻怎么都重復(fù)不出來(lái)。求高人指點(diǎn)。
上圖為現(xiàn)在的情況，下圖為預(yù)實(shí)驗(yàn)提取的情況，所用maker均為Takara DL15000。

未標(biāo)題-1.jpg

提取-1.png

[ Last edited by Yocan2012 on 2014-3-18 at 13:18 ]

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1樓 2014-03-18 13:16:07

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花雨sky

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用不用tris飽和酚問(wèn)題不是很大，我沒(méi)有用也還是提出來(lái)了
1、藥品有沒(méi)有問(wèn)題
2、研磨是否充分，這個(gè)很關(guān)鍵，如果研磨不充分的話，就得不到CTAB-核酸復(fù)合物，自然就看不到DNA了
3、浸提、抽提等各個(gè)步驟的動(dòng)作一定要溫和。
這有個(gè)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，希望能對(duì)你有幫助http://huanansu211.blog.163.com/ ... 544720105291551541/

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5樓2014-03-18 16:38:54

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9樓: Originally posted by Yocan2012 at 2014-03-18 21:46:02
您的連接已仔細(xì)看過(guò)，很有幫助。可能離心的過(guò)程中溫度有點(diǎn)低，不過(guò)在加乙醇和乙酸鈉之后白色絮狀物還是很多的，應(yīng)該不會(huì)是DNA被離心下去了吧。...

不就是要收集沉淀的嘛，我加完乙醇和乙酸鈉之后沉淀半個(gè)小時(shí)，離心收集沉淀，再進(jìn)行乙醇清洗沉淀。要是你加完之后白色絮狀物很多的話就可以直接離心收集沉淀，，不用等半個(gè)小時(shí)了，這種做法的前提是你的DNA量要多。抽提時(shí)候低溫，CTAB浸提后離心要上清液的這次離心溫度不能低于15度喲。

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10樓2014-03-19 18:54:34

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11樓: Originally posted by Yocan2012 at 2014-03-20 09:27:01
白色沉淀非常多，然后離心，洗滌，加TE溶解。但是上樣跑膠后，就是上面那個(gè)死樣子。不過(guò)，nanodrop上面測(cè)的核算濃度卻能達(dá)到幾百納克每微升。...

估計(jì)是雜質(zhì)含量較高，你的材料里富含多糖、多酚嗎，可以在CTAB之前，樣品研磨完之后用TE-NaCl清洗幾次。

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12樓2014-03-20 11:30:04

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你的電泳圖下方過(guò)亮有點(diǎn)看不清楚，但粗略看可能是你提到的DNA降解了，你在提取過(guò)程中有沒(méi)有劇烈的震蕩？

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2樓2014-03-18 16:00:55

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yipan

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不要?jiǎng)×覔u晃，操作應(yīng)該溫和，這樣才能最大化的保證DNA的完整性。

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3樓2014-03-18 16:14:50

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植物DNA的提取技術(shù)及注意事項(xiàng)
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4樓2014-03-18 16:33:00

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2樓: Originally posted by starseeker at 2014-03-18 16:00:55
你的電泳圖下方過(guò)亮有點(diǎn)看不清楚，但粗略看可能是你提到的DNA降解了，你在提取過(guò)程中有沒(méi)有劇烈的震蕩？

我也認(rèn)為是降解了。但是操作一直很小心，所以應(yīng)該不是劇烈震蕩的原因。

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6樓2014-03-18 17:22:57

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3樓: Originally posted by yipan at 2014-03-18 16:14:50
不要?jiǎng)×覔u晃，操作應(yīng)該溫和，這樣才能最大化的保證DNA的完整性。

操作很小心，中間沒(méi)有劇烈震蕩。

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7樓2014-03-18 17:23:36

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4樓: Originally posted by zhenwuhuang at 2014-03-18 16:33:00
植物DNA的提取技術(shù)及注意事項(xiàng)
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您的連接已仔細(xì)看過(guò)，非常感謝！

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8樓2014-03-18 21:43:14

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5樓: Originally posted by 花雨sky at 2014-03-18 16:38:54
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3、浸提、抽提等各個(gè)步驟的動(dòng)作一定 ...

您的連接已仔細(xì)看過(guò)，很有幫助。可能離心的過(guò)程中溫度有點(diǎn)低，不過(guò)在加乙醇和乙酸鈉之后白色絮狀物還是很多的，應(yīng)該不會(huì)是DNA被離心下去了吧。

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