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lihuahan銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于原核表達(dá)載體構(gòu)建，跪求~~~~ 已有2人參與
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生物新手，有兩個問題想求助一下： 1.現(xiàn)在要構(gòu)建一個原核表達(dá)載體，我查的有兩種方案，第一種是將目的基因PCR后直接連接到表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株中，第二種是把目的基因連接到克隆載體，再酶切后再連接到表達(dá)載體，最后再轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌種，請問第二步中的克隆菌株有必要嘛？哪種方案比較可行？ 2.在得到cDNA后，第一種是通過設(shè)計引物反轉(zhuǎn)錄得到目的基因的DNA，再對它雙酶切，第二種是設(shè)計兩端含有酶切位點的引物并添加保護(hù)堿基，再通過反轉(zhuǎn)錄直接得到雙酶切后的目的基因，哪種比較可行？謝謝~~~~~~~~~~ |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
lihuahan(gyesang代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流經(jīng)驗！ 2014-04-01 23:47:49
lihuahan(gyesang代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流經(jīng)驗！ 2014-04-01 23:47:49
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懂你的意思了。。。。 你所謂的pMD應(yīng)該是個T/A克隆載體吧？ 我一般不這樣干，多出一輪克隆，浪費時間 但是遇見很難克隆的片段，比如怎么也拿不到太多的情況下 先T/A克隆獲得片段是上策 但是即便是這樣，跟酶切位點保護(hù)堿基也沒有關(guān)系，你即便是做好T/A克隆的準(zhǔn)備，也最好先就帶上酶切位點，如果很容易拿到，直接克隆到表達(dá)載體不就完事了？ |
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lihuahan6樓2014-04-01 22:51:47
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
lihuahan(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵熱心回帖交流 2014-04-01 13:29:22
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
lihuahan(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵熱心回帖交流 2014-04-01 13:29:22
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混亂，一篇混亂。 第一個問題 不明白為什么還有個“克隆質(zhì)�！保� 你要表達(dá)某個基因，你就直接把這段基因片段插到你的表達(dá)載體就可以了�？寺≥d體是最基本的載體，可以裝片段的載體幾乎都可以叫克隆載體，表達(dá)載體至少可以說是“可以表達(dá)的克隆載體”。 倒是后面一段可能需要點理解，那為什么表達(dá)載體要經(jīng)過“克隆菌”到“表達(dá)菌”的過程呢？ 一般而言，表達(dá)載體都是在克隆菌里面做克隆鑒定的，不建議直接轉(zhuǎn)化表達(dá)菌，因為表達(dá)載體在表達(dá)菌中的情況比較復(fù)雜，可能因為泄露表達(dá)等原因?qū)е卤磉_(dá)菌生長受阻。 第二個問題 這個“反轉(zhuǎn)錄"不是這樣亂用的 我不太明白你的意思 你所謂的cDNA，就是mRNA做反轉(zhuǎn)錄之后的cDNA第一鏈， ”通過反轉(zhuǎn)錄直接得到雙酶切后的目的基因“ 這到底是什么意思？ |
2樓2014-04-01 09:18:55
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4樓2014-04-01 22:39:50
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8樓2014-04-02 10:12:29
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5樓2014-04-01 22:41:52
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7樓2014-04-01 23:18:22
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你好，有幾個問題想請教一下，1.在原核表達(dá)載體構(gòu)建的時候，從目的基因的CDS序列里應(yīng)該怎么找閱讀框呢？現(xiàn)在已經(jīng)有cDNA的第一鏈，是把目的基因的閱讀框給公司再告訴他們酶切位點就可以得到兩端帶有酶切位點的引物嘛？2.原核表達(dá)載體應(yīng)該怎么選擇尼？我后期是純化目的蛋白，pET-30a可行嗎？如果可行的話，我看它的BamHI酶切位點是識別GGA三聯(lián)密碼子開始的閱讀框，是不是要在引物的保護(hù)堿基后邊加上GGA呢？ [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
9樓2014-04-30 10:24:59
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10樓2014-04-30 10:51:37
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