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lihuahan銀蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于原核表達(dá)載體構(gòu)建，跪求~~~~ 已有2人參與
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生物新手，有兩個(gè)問(wèn)題想求助一下： 1.現(xiàn)在要構(gòu)建一個(gè)原核表達(dá)載體，我查的有兩種方案，第一種是將目的基因PCR后直接連接到表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株中，第二種是把目的基因連接到克隆載體，再酶切后再連接到表達(dá)載體，最后再轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌種，請(qǐng)問(wèn)第二步中的克隆菌株有必要嘛？哪種方案比較可行？ 2.在得到cDNA后，第一種是通過(guò)設(shè)計(jì)引物反轉(zhuǎn)錄得到目的基因的DNA，再對(duì)它雙酶切，第二種是設(shè)計(jì)兩端含有酶切位點(diǎn)的引物并添加保護(hù)堿基，再通過(guò)反轉(zhuǎn)錄直接得到雙酶切后的目的基因，哪種比較可行？謝謝~~~~~~~~~~ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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lihuahan(gyesang代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流經(jīng)驗(yàn)！ 2014-04-01 23:47:49
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懂你的意思了。。。。 你所謂的pMD應(yīng)該是個(gè)T/A克隆載體吧？ 我一般不這樣干，多出一輪克隆，浪費(fèi)時(shí)間 但是遇見(jiàn)很難克隆的片段，比如怎么也拿不到太多的情況下 先T/A克隆獲得片段是上策 但是即便是這樣，跟酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基也沒(méi)有關(guān)系，你即便是做好T/A克隆的準(zhǔn)備，也最好先就帶上酶切位點(diǎn)，如果很容易拿到，直接克隆到表達(dá)載體不就完事了？ |
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lihuahan6樓2014-04-01 22:51:47
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
lihuahan(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2014-04-01 13:29:22
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
lihuahan(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2014-04-01 13:29:22
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混亂，一篇混亂。 第一個(gè)問(wèn)題 不明白為什么還有個(gè)“克隆質(zhì)�！保� 你要表達(dá)某個(gè)基因，你就直接把這段基因片段插到你的表達(dá)載體就可以了。克隆載體是最基本的載體，可以裝片段的載體幾乎都可以叫克隆載體，表達(dá)載體至少可以說(shuō)是“可以表達(dá)的克隆載體”。 倒是后面一段可能需要點(diǎn)理解，那為什么表達(dá)載體要經(jīng)過(guò)“克隆菌”到“表達(dá)菌”的過(guò)程呢？ 一般而言，表達(dá)載體都是在克隆菌里面做克隆鑒定的，不建議直接轉(zhuǎn)化表達(dá)菌，因?yàn)楸磉_(dá)載體在表達(dá)菌中的情況比較復(fù)雜，可能因?yàn)樾孤侗磉_(dá)等原因?qū)е卤磉_(dá)菌生長(zhǎng)受阻。 第二個(gè)問(wèn)題 這個(gè)“反轉(zhuǎn)錄"不是這樣亂用的 我不太明白你的意思 你所謂的cDNA，就是mRNA做反轉(zhuǎn)錄之后的cDNA第一鏈， ”通過(guò)反轉(zhuǎn)錄直接得到雙酶切后的目的基因“ 這到底是什么意思？ |
2樓2014-04-01 09:18:55
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3樓2014-04-01 17:30:35
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4樓2014-04-01 22:39:50
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8樓2014-04-02 10:12:29
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5樓2014-04-01 22:41:52
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7樓2014-04-01 23:18:22
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你好，有幾個(gè)問(wèn)題想請(qǐng)教一下，1.在原核表達(dá)載體構(gòu)建的時(shí)候，從目的基因的CDS序列里應(yīng)該怎么找閱讀框呢？現(xiàn)在已經(jīng)有cDNA的第一鏈，是把目的基因的閱讀框給公司再告訴他們酶切位點(diǎn)就可以得到兩端帶有酶切位點(diǎn)的引物嘛？2.原核表達(dá)載體應(yīng)該怎么選擇尼？我后期是純化目的蛋白，pET-30a可行嗎？如果可行的話，我看它的BamHI酶切位點(diǎn)是識(shí)別GGA三聯(lián)密碼子開(kāi)始的閱讀框，是不是要在引物的保護(hù)堿基后邊加上GGA呢？ [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
9樓2014-04-30 10:24:59
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10樓2014-04-30 10:51:37
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