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小沫沫188新蟲 (初入文壇)
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關(guān)于設(shè)計克隆引物時產(chǎn)物片段大小有限制嗎，如果我沒有全長要怎么做能克隆到它的全長 已有2人參與
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請問，1.設(shè)計克隆的引物，產(chǎn)物片段是不是太長就不好擴(kuò)增啊？我在orf finder 比對閱讀框， 顯示完整的開放閱讀框有4kbp左右，那么如果我要克隆這個基因的全長，怎么限定上下游引物呢，一定要在atg前taa后嗎？克隆引物產(chǎn)物長度是不是不能太長？如果需要去掉里面的內(nèi)含子怎么知道哪幾段是內(nèi)含子呢 2.如果一個基因我沒有它的全長，只有部分序列，比如只有部分CDS序列，要怎么設(shè)計引物呢，聽說要用到5“race，怎么感覺那么復(fù)雜，還請各位前輩賜教 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵熱心回帖交流 2014-04-09 14:15:50
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵熱心回帖交流 2014-04-09 14:15:50
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知道一部分序列，要擴(kuò)全長，用RACE是最快的吧…… 只是RACE做起來，試劑盒會比較貴，不用試劑盒好像也可以，自己準(zhǔn)備Oligo引物什么的也可以，我看到網(wǎng)上有不少大神總結(jié)的不用試劑盒做RACE的……都是牛人啊 用試劑盒的話，Smart和Takara的盒子用的人比較多，羅技的貴，國產(chǎn)有幾個牌子，SuperSwitch的似乎還可以。 RACE引物一般設(shè)計兩對，一個通用引物（好像是這名兒）一個巢式引物，試劑盒里會有說明，網(wǎng)上應(yīng)該也能搜到，根據(jù)你已知的序列去找，要求無非也就是TM比較高，GC含量比較好，blah。 5‘RACE在反轉(zhuǎn)錄的時候，在cDNA的末端加上一個帽子結(jié)構(gòu)，這樣一來，相當(dāng)于你已經(jīng)知道了5’末端的序列，也知道一段中間的序列，然后中間設(shè)計一個引物，5‘用一個Oligo引物，PCR擴(kuò)增就可以得到從已知序列到5’的全部序列了。 在第一輪PCR的時候，因為很多你的引物有可能跟不同基因都有結(jié)合，P出來的不一定都是你的目的基因，所以要進(jìn)行第二輪nest，巢式引物比第一輪的引物更靠近5’。將第一輪的反應(yīng)液回收，稀釋，作為模板跑nest，這樣在第二輪PCR中，得到的條帶就一定是你的目的基因，接下來就克隆測序就行，如果不放心還可以設(shè)計更靠近5‘的第三輪引物。 關(guān)鍵是在做5’RACE的時候，RNA質(zhì)量很重要，質(zhì)量不好后面全部白費，在反轉(zhuǎn)錄時，cDNA有時候加不上帽子結(jié)構(gòu)，后面也做不出來……PCR體系，熱啟動酶和模板多多少少都會有點影響……所以做RACE有時候會很頭疼的…… 我看論壇里各種前輩總結(jié)，如果RNA質(zhì)量好，引物設(shè)計恰當(dāng)，用比較好的試劑盒一周就能出結(jié)果的。 一個5‘RACE，一個3’RACE，兩頭測序結(jié)果一拼就得到基因全長了，很方便。 3‘RACE是利用Poly（A）尾，原理是一樣的，3’比5‘好做。 我覺得RACE這種東西……有時候是要靠人品��！ 祝樓主好運啊��！ |
2樓2014-04-09 09:26:58
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10樓2014-04-16 10:10:50
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