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銀小耳金蟲 (小有名氣)
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感受態(tài)轉(zhuǎn)化及陽性克隆出現(xiàn)問題 已有6人參與
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大腸桿菌DH5a感受態(tài)轉(zhuǎn)化 1、從-70℃冰箱中取感受態(tài)細(xì)胞懸液,冰上解凍5min。 2、 加入連接產(chǎn)物10μl (含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕彈勻,冰上放置30min。 3、42℃水浴中熱擊90秒,熱擊后迅速置于冰上冷卻3min。 4、向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37℃,100r/min搖床培養(yǎng)1h,使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài) 5、將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于LB平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)16-24小時。 PCR驗(yàn)證陽性克隆 1.使用無菌白槍頭將轉(zhuǎn)化后長出的白色單菌落點(diǎn)種轉(zhuǎn)移到含有氨芐青霉素的平板上，37℃過夜培養(yǎng) 2.挑取氨芐平板上的單菌落到含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，180rpm/min，37℃搖床培養(yǎng)3h 3.取2ml菌液作為PCR模板，PCR反應(yīng)引物為T載體通用引物：RV-M和M13-17 4.PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，排除部分假陽性克隆片段 實(shí)驗(yàn)每次都是卡在PCR驗(yàn)證陽性克隆的第二步，37度搖床培養(yǎng)3h后培養(yǎng)基都很澄清，基本沒有菌長出來，之前條白色單菌落到含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中時，明顯可以看到菌落接進(jìn)去了呀，求大神幫幫忙看到底是哪里出了差錯？？ |
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kueradi
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5樓2014-04-18 20:50:23
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